【正文】 得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。瓊脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀且邊緣不齊。表341 蠟樣芽孢桿菌與其他類似的鑒別特 性巨大芽孢桿菌蠟樣芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌蕈狀芽孢桿菌炭疽芽孢桿菌過氧化氫酶＋＋＋＋＋動 力＋/－＋/－＋/－－－硝酸鹽還原－＋＋＋＋酪蛋白分解＋/－＋＋/－＋/－－/＋卵黃反應－＋＋＋＋葡萄糖利用（厭氧）－＋＋＋＋甘露醇＋－－－－木 糖＋/－－－－－溶 血－＋＋－/＋－/＋已知致病特性產生腸毒素對昆蟲致病的內毒素結晶假根樣生長對動物和人致病注：“＋”90～100%的菌株陽性。如有游離芽孢和深染了的，似菱形的紅色結晶小體即為蘇云金芽孢桿菌（如游離芽孢未形成，培養(yǎng)物應放置室溫再保持1～2d后查檢），而蠟樣芽孢桿菌用此法檢查為陰性。2 基本原理副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是近海岸、河口處的棲息生物，常存在于海水、海底沉積物、海產品（魚類、介殼類）及海漬食品中。3．2 檢樣 魚類、貝類。4．4分離培養(yǎng)取增菌液1環(huán)劃線接種于TCBS平板，于37℃培養(yǎng)18～24h后，觀察平板上生長的菌落，～、綠色或藍綠色的為可疑菌落。4．8生化試驗分別接種下列各類微量生化培養(yǎng)基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛基質、VP，賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗，放37℃培養(yǎng)，除VP、靛基質和甲基紅試驗培養(yǎng)48h后加試劑觀察外，其他均在24h觀察結果。7 思考題（1）副溶血性弧菌在TCBS平板上有何菌落特征？為什么？（2）鑒定致病性副溶血性弧菌的重要指標是什么？實驗9 食品中空腸彎曲桿菌的檢驗1 目的要求（1）了解空腸彎曲桿菌的生長特性。空腸彎曲桿菌已涉及生的和未煮熟的雞、生的和巴氏殺菌不徹底的牛奶、蛋制品、生火腿、未經氯處理的水。對糖類既不發(fā)酵也不氧化，呼吸代謝無酸性或中性產物。3．2檢樣 碎牛肉、牛奶、雞、污水。將均質液通過滅菌紗布，倒入250mL三角瓶中，于微氧條件下，37℃預增菌4h后，42℃培養(yǎng)20～44h。于微需氧條件下，35℃預增菌4h后，42℃培養(yǎng)20～44h。將平皿置于微需氧條件下42℃培養(yǎng)24～48h。挑取初步鑒定為彎曲桿菌的菌落，在布氏瓊脂上劃線作純分離。%瓊脂的布氏肉湯。另二管分別置于25℃和42℃培養(yǎng)。(2) 過氧化氫酶試驗滴加3%過氧化氫溶液于有細菌生長的試管中，產生氣泡者為陽性反應。加入亞硝酸鹽檢測試劑，出現(xiàn)紅色者為陽性反應。對未出現(xiàn)陽性反應者需培養(yǎng)5d，方可作出最后判斷。(10) 馬尿酸鹽水解試驗用試管分裝馬尿酸鹽水解培養(yǎng)基，凍存?zhèn)溆?。將頭孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圓紙片分別貼于平板表面。R為耐受，S為敏感。7 思考題（1）空腸彎曲菌生長的條件是什么？（2）如何鑒定一種細菌是空腸彎曲菌？實驗10 食品中肉毒梭狀芽孢桿菌及肉毒毒素的檢驗1目的要求（1）了解肉毒梭狀芽孢桿菌的生長特性和產毒條件。其它引起中毒的食品還有：熏制未去內臟的魚、填餡茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋蔥、蜂蜜制品等。菌落半透明，表面呈顆粒狀，邊緣不整齊，界線不明顯，向外擴散，呈絨毛網狀，常常擴散成菌苔。肉毒梭菌的致病性在于所產生的神經毒素即肉毒毒素，而細菌本身則是一種腐生菌。F、G型肉毒梭菌極少分離，未見G型菌引起人群的中毒報道。肉毒中毒是由于誤食含有肉毒毒素的食品而引起的純粹的細菌毒素食物中毒。3．3 培養(yǎng)基與試劑 庖肉培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、明膠磷酸鹽緩沖液、肉毒分型抗毒素診斷血清、胰酶（活力1：250）、革蘭氏染色液。另取一部分上清液，調pH6．2，每9份加10％胰酶(活力1：250)水溶液一份，混勻，經常輕輕攪動，37℃作用60min，進行檢測。主要癥狀為豎毛、四肢癱軟、呼吸困難、呼吸呈風箱式，腰部凹陷，宛如峰腰，最終死于呼吸麻痹。3份混合液分別注射小白鼠各2只，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護存活，而唯有注射未經其他處理的混合液的小白鼠以特有癥狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時進行毒力測定及定型試驗。（4 ）定型試驗按毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10～1 000 LD／mL的范圍，分別與各單型肉毒抗毒診斷血清等量混勻，37℃作用30 min，各注射小白鼠2只，觀察4d。檢出肉毒梭菌，但未檢出肉毒毒素，不能證明此食物會引起肉毒中毒。以上接種物于30℃培養(yǎng)5d，若無生長，可再培養(yǎng)10d。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種皰肉培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)5d，進行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗。6 注意事項（1）典型的肉毒中毒，小白鼠會在4~6h內死亡，而且98～99%的小白鼠會在12h內死亡，因此，試驗前24h內的觀察是非常重要的。小白鼠的飼料與水必須及時添加、充分供應。據(jù)報道，～16%，有70%的人可短期帶菌，4～8%的水產品、5～10%的奶及其產品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。該菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小約為（～）μm（～）μm，直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無芽孢，一般不形成莢膜，但在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。在5～7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產生窄小的β溶血環(huán)。3．2 食品 雞肉、生牛排、鮮牛奶、芹菜。4．3 分離共培養(yǎng)24h和48h后，取EB培養(yǎng)物分別在MMA瓊脂平板、科瑪嘉李斯特菌培養(yǎng)基平板上劃線，置于30℃培養(yǎng)48h，然后，把MMA平板放于解剖鏡載物臺上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。食品檢驗中在TSAYE平板上純化是必須的，因為在MMA平板上分離菌落時可能沾有不可見的受抑微生物。在TSAYE上用已知菌作對照。30℃TSAYE平板培養(yǎng)24～48h，如果不用于動力觀察，也可在35℃培養(yǎng)。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對照。3．4其他 均質器、顯微鏡、小鼠。在科瑪嘉李斯特菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天就可見蘭色菌落。該菌的生長范圍為2～42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為35～37℃，在pH中性至弱堿性（）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，～，% NaCl 肉湯中生長良好。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。（2）熟悉單核細胞增生李斯特氏菌的分離鑒定方法。（2）如果小白鼠注射經1：2或1：5倍數(shù)稀釋的樣品后死亡，但注射更高稀釋度的樣品后未死亡，這也是非?？梢傻默F(xiàn)象，一般為非特異性死亡。肉毒梭菌只有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長并形成具有上述特征的菌落，而在需氧條件下則不生長。（2）分離培養(yǎng)選取經毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產毒培養(yǎng)物（必要時可重復一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養(yǎng)48h。4．3 肉毒梭菌的檢驗與分離鑒定肉毒梭菌檢驗方法的重點乃是產毒及毒素的檢出試驗，如要證實是否有肉毒梭菌存在，只要分離、培養(yǎng)、毒素鑒定即可。能保護動物免于發(fā)病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。根據(jù)動物死亡情況，計算檢樣中所含肉毒毒素的大體毒力(MLD／mL或MLD／g)。（2）確證試驗不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成3份進行試驗。檢出試驗：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠2只，觀察4d。4 實驗方法與步驟4．1 肉毒梭狀芽孢桿菌及毒素的檢驗程序(如圖371)4．2肉毒毒素的檢出肉毒中毒的診斷，重要的是毒素的檢出及定型；罐頭食品的細菌學檢驗，有時需要證實肉毒梭菌的存在，不過，最終還是要根據(jù)產毒試驗來鑒定細菌及其型別。3 實驗材料3．1 樣品 罐頭、臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等發(fā)酵食品。C型包括CC2二個亞型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。在乳糖卵黃牛奶平板上，菌落下培養(yǎng)基為乳濁，菌落表面及周圍形成彩虹薄層，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，常常在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。肉毒梭狀芽孢桿菌具有4～8根周毛性鞭毛，運動遲緩；沒有莢膜。2 基本原理肉毒梭菌廣泛存在于自然界，引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。6 注意事項（1）所檢樣品在室溫中放置不能超過24h，樣品在分離前需放冰箱或冷處保存?？漳c彎曲桿菌屬各個種的生化特性見表361。(:1丙酮和丁醇中)，室溫下放置2h，出現(xiàn)紫色者為陽性反應?？漳c彎曲菌不產生硫化氫，所有彎曲桿菌屬為堿性/堿性反應。(6) %氯化鈉中生長試驗%氯化鈉的基礎培養(yǎng)基中，置空氣中于37℃，對未生長者需培養(yǎng)5d，方可作出最后判斷。將氧化酶試劑滴于棉拭子上，用棉拭子接觸生長物表面，接觸點變?yōu)樯钏{色者為陽性。對未生長者，需培養(yǎng)5d方可作出最后判斷。從所有布氏肉湯中取出接種物，～。4．3 證實試驗從用作純分離的平板上挑選二個典型菌落。挑取典型菌落制作濕片，用相差(或暗視野)顯微鏡檢查，本菌呈快速螺旋運動。4．2 分離和初步鑒定取5mL經20～44h增菌的培養(yǎng)物。于微氧條件下，37℃預增菌4h后，42℃培養(yǎng)20～44h。3．4其他用品 生化試劑。在血瓊脂上，初分離出現(xiàn)兩種菌落特征：第一型菌落不溶血，灰色，扁平，潤濕，有光澤，看上去像水滴，邊緣不規(guī)則，常沿劃線生長；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的單個菌落（直徑1mm～2mm），邊緣整齊，半透明，有光澤，中心稍渾，呈單個菌落生長?？漳c彎曲桿菌是一類微需氧菌，初次分離時需在含5%O285%N210%CO2環(huán)境中，該菌相對脆弱，對周圍環(huán)境敏感，如對干燥、加熱、消毒、酸性和21%氧氣都敏感。2 基本原理空腸彎曲桿菌廣泛存在于鳥、禽、貓、狗等動物體內，從牛奶、蟹肉、河水和無癥狀人群糞便中可分離到此菌。6 注意事項（1）副溶血性弧菌在適宜溫度下繁殖較快，但不適于在低溫生存，在寒冷的情況下容易死亡，所以應防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗結果。4．6涂片鏡檢將三糖鐵培養(yǎng)基上反應可疑者即底層變黃(葡萄糖產酸不產氣)、上層斜面不變 (乳糖、蔗糖不分解)、有動力、不產生硫化氫，進行革蘭氏染色鏡檢形態(tài)。4 實驗方法與步驟4．1 副溶血性弧菌的檢測程序（表351）37℃，18～24h37℃，18～24h37℃8～16h樣品25g加225mL ％滅菌鹽水，磨碎氯化鈉結晶紫增菌液100mL氯化鈉蔗糖瓊脂平板和選擇性瓊脂平板％氯化鈉三糖鐵斜面嗜鹽性試驗涂片革蘭氏染色鏡檢形態(tài)生化試驗報告圖351 食品中副溶血性弧菌的檢驗程序4．2樣品處理準備好滅菌用具及容器，以無菌操作取有代表性的樣品25g，%滅菌鹽水中，用均質器打碎或用力搖勻10～20min。副溶血性弧菌是一種嗜鹽性弧菌，在不含NaCl培養(yǎng)基中不生長，在TCBS平板上，～，因不發(fā)酵蔗糖而呈綠色或藍綠色。7 思考題如何區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌？實驗8 食品中副溶血性弧菌的檢驗1 目的要求（1）了解副溶血性弧菌的生長特性。本菌在生化性狀上與蘇云金芽孢桿菌極為相似，但后者可通過細胞內產生蛋白質毒素結晶加以鑒別。（4）與類似菌鑒別。4．4 證實試驗（1）形態(tài)觀察：應為G+桿菌，寬度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為灰白色或微帶紅色，具紫紅色背景(表示不發(fā)酵甘露醇)環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈(表示產生卵磷脂酶)。1℃ 20h12～36177。蠟樣芽孢桿菌食物中毒中涉及的食品種類較多，包括乳類食品、肉類食品、蔬菜、湯汁、豆芽、甜點心和米飯等，引起的食物中毒表現(xiàn)為嘔吐型和腹瀉型。（1）根據(jù)培養(yǎng)和生化試驗，有否檢出志賀氏菌？（2）根據(jù)生化特性和血清學試驗，檢出的志賀氏菌屬哪個群？哪個型？7 思考題（1）志賀氏菌屬有哪些重要的生化特性？（2）你認為在志賀氏菌屬檢驗過程中，哪些試驗是不可缺少的?實驗7 食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗1目的要求（1）學習蠟樣芽孢桿菌檢驗的原理和方法。福氏志賀氏菌各型和亞型的型和群抗原的血清學鑒定見表33333。要將志賀氏菌屬分型，還需進行血清學試驗，具體為：挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，作玻片凝集試驗。志賀氏菌在三糖鐵瓊脂內的反應結果為底層產酸而不產氣(福氏志賀氏菌6型可微產氣)，斜面產堿，不產生硫化氫，無動力，在半固體管內沿穿剌線生長。１℃，18－24hTSI底層產酸，斜面產堿， H2S－，不產氣，無動力非如左述的各種反應結果血清學分型生化分群試驗志賀氏菌屬分群及分型結果進一步的生化試驗葡萄糖銨試驗、西蒙氏檸檬酸鹽、賴氨酸、尿素、KCN、水楊苷和七葉苷葡萄糖銨＋或任何其他陽性結果非志賀氏菌非志賀氏菌報 告圖331 志賀氏菌檢驗程序4．3 分離 取一環(huán)增菌液，劃線接種于HE瓊脂平板或SS平板一個，麥康凱瓊脂平板或伊紅美蘭瓊脂平板一個，于36177。4 實驗方法與步驟4．1 志賀氏菌檢驗程序（如圖331）4．2 增菌稱取檢樣25g加入裝有225mL GN增菌液的500mI廣口瓶內（固體食品應用均質器以8，000～10，000r/mi打碎1min，或用研缽研碎），于培養(yǎng)36177。志賀氏菌的鑒定主要根據(jù)血清學反應，再以生化反應證實。6 思考題（1）如何提高沙門氏菌的檢出率？（2）沙門氏菌在三糖鐵培養(yǎng)基上的反