電泳技術(shù)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用(存儲版)
【正文】 不被分離，而是被濃縮為最小體積 蛋白質(zhì)亞基在分離膠根據(jù)分子量的大小被分離 考馬斯亮藍(lán)染色 ( ) OneDimensional SDSPAGE Isoelectric Focusing (IEF) 等電聚焦電泳的過程 電泳時(shí)可將樣品置于凝膠的任何位置； 初始位置在負(fù)極時(shí)，因 pH＞ pI，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電，電泳時(shí)向正極移動；移動過程中， pH逐漸下降，所帶負(fù)電荷量逐漸減少，蛋白質(zhì)移動速度減慢；當(dāng)移動到 pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零， 蛋白質(zhì)即停止移動； 各種不同蛋白質(zhì)在電泳結(jié)束后，會分別聚集于相應(yīng)的等電點(diǎn)位置，形成一個(gè)很窄的區(qū)帶；區(qū)帶的位置是由 pH梯度的分布和蛋白質(zhì)的 pI所決定，而與蛋白質(zhì)分子的大小和形狀無關(guān)。 加入二抗溶液，搖床上緩慢搖動， 37℃ 2 小時(shí)。 正極 三層濾紙 硝酸纖維素濾膜 凝膠 三層濾紙 負(fù)級 轉(zhuǎn)膜后檢測 麗春紅 S染色 預(yù)染蛋白 marker 考馬斯亮藍(lán)染色 封閉 : 膜上的空白位點(diǎn) 脫脂奶粉（ 5％） BSA(牛血清白蛋白 ) 一抗、標(biāo)記二抗孵育 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以 與濾膜溫育， 4 ℃ 過夜。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在 15KD到 200KD之間時(shí) ， 電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 。一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠 . 與瓊脂糖凝膠電泳的比較 , PAGE的特點(diǎn) ?分辨率很強(qiáng)，長度上相差 1bp的 DNA即可分開； ?從聚丙烯酰胺凝膠中回收的 DNA純度很高，可適用于要求最高的實(shí)驗(yàn)（如胚胎注射）； ?裝載更多的 DNA量； ?最適合分離小片段 DNA(5500bp),可以分離 蛋白質(zhì) 。 將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn) DNA的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知 DNA片段在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其分子量。 含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍 凝膠中的瓊脂糖含量
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