生化與分子生物學(xué)技術(shù)原理(存儲(chǔ)版)
【正文】 苷 nucleoside Ns 堿基 嘌呤 purine Pu 嘧啶 pyrimidine Py 堿基三字符號(hào) Ade Cyt Gua Thy Ura Ns單字符號(hào) (d) A C G T U Ns, Nt, oligoNts 中均為 D戊糖 堿基可異構(gòu)化 異構(gòu)平衡僅 H 原子位置變化 UV,NMR分析 生理 pH 條件下 , 5種堿基 % 以氨基與酮式存在 。 兩個(gè)原子偏離糖平面的程度可以相等或不等 C2’endoC3’exo C2’exoC3’endo 側(cè)視圖 ? 存在 溶液 : Nt , Ns C2’endo ~ C3’endo DNA : BDNA C2’endo ADNA(RNA) C3’endo ZDNA 胞苷 (C) C2’endo ( 反式） 鳥苷 (G) C3’endo（順式 ） (Bform double DNA) (Aform double DNA) 三 . 核苷的順反構(gòu)象 ( synanti 構(gòu)象 ) 核糖和堿基以 N糖苷鍵連接成核苷，核苷中堿基平面繞糖苷鍵旋轉(zhuǎn)形成核苷的順反構(gòu)象。 ? 溫和 ( Soft ) 烷化劑 硫酸二甲酯 甲基硫烷 烷基化物 DMS MMS MeI Me N GN7 AN1 CN3 TN3 DMS作用于 dsDNA AN3(Me) , 阻止 DNA pol. ? 強(qiáng) (Hard) 烷化劑 N甲基 N亞硝基脲 (MNU) N乙基 N亞硝基脲 (ENU) Me N , O 核酸 50% 磷酸酯烷化 烷化劑直接致癌 DMS GO6 : GN7 = : 1 MNU GO6 : GN7 = : 1 ( 肝 ) GO6 : GN7 = : 1 ( 腦 ) GN7(Me)不改變 G:C配對(duì) GO6(Me)不影響 DNA pol,但改變堿基對(duì) , G T b. 鹵化反應(yīng) 嘧啶 5 位 5FU 抗癌藥 鹵素分子 嘌呤 8 位 8BrPu 標(biāo)記 c. 與醛類反應(yīng) 堿基的 環(huán)外 –NH2 AMP: N6NH2 GMP: N2NH2 甲醛是 DNA不可逆變性劑 ?鑒定 ssDNA or dsDNA ?破壞 RNA高級(jí)結(jié)構(gòu) ， 消除結(jié)構(gòu)對(duì)電泳遷移 率的影響 d. 核糖上的反應(yīng) ? 核糖的氧化反應(yīng) 核糖的 2’， 3’順二醇 被高碘酸 ( HIO4)氧化成 順二醛 ，胺催化 β 消除反應(yīng) ，同時(shí)堿基脫落 , 生成磷酸，堿基和糖碎片。 ? 稀有成分的吸收光譜特征常不同于常見成分 第二章 核酸的分離純化 一 . 細(xì)胞中的核酸 1. 存在狀態(tài) 與蛋白質(zhì)結(jié)合 (除 tRNA ) 2. 分布 DNA : 原核 核質(zhì)區(qū) 真核 95%核內(nèi) 5%核外（ mt,ct ) RNA : 原核 胞質(zhì) 真核 90%質(zhì) (15%細(xì)胞器） 10%核 少 , 細(xì)胞干重 515%, 10ˉ15 10ˉ10 g / cell RNA 104106 Da DNA ＞ 106 Da 二 .制備中注意事項(xiàng) 保持生物學(xué)功能 ,具有生物活性 分子完整 ,天然狀態(tài) (未變性 ) 04℃ pH 59 （ shearing ) 5. 防止核酸酶降解作用 a. DNase 活性需要 Me2+( Mg 2+, Ca2+, Mn2+…… ) 螯合劑 ? SSC 檸檬酸三鈉 NaCl ? EDTANa2 乙二胺四乙酸鈉 ( Me2+) ? EGTA 乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+ 特異性 ) b. RNase 活性不需 Me2+，熱穩(wěn)定，回復(fù)能力強(qiáng) . ● 防止外源 RNase污染 污染源：器皿、溶液、操作者． 措施 ? 180℃ 高溫處理數(shù)小時(shí) ? % DEPC（二乙基焦碳酸鹽 )處理 O O 蛋白變性劑 C2H5–O–C–O–C–O–C2H5 共價(jià)修飾 RNase ? 操作者 ● 抑制內(nèi)源 RNase 盡早、徹底去蛋白 ? 非專一性吸附劑 RNase 堿性蛋白（ pI ） ,中性 pH下 靜電吸附． 皂土、復(fù)合硅酸鹽（ Macaloid）、多聚陰 離子（肝素、聚乙烯硫酸酯）． ? 蛋白變性劑 異硫氰酸胍、 SDS （十二烷基硫酸鈉） 破細(xì)胞同時(shí)使 RNase 失活 ? RNase 抑制劑 RNasin 465aa 酸性蛋白（鼠肝、人胎盤） 與 RNase結(jié)合，保護(hù) RNA, 不用于提取． ? 核苷酸底物類似物 –—競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 ApUp RNaseA G2’5’G RNaseT1 三 . 核酸的分離提取 總核酸 目的核酸 細(xì)胞器 目的核酸 ? 物理法 石英沙研磨、超聲、勻漿、搗碎器． ? 化學(xué)法 去污劑、蛋白變性劑破膜 ? 生化法 溶菌酶、蛋白酶 動(dòng)、植物材料 液 N2, 機(jī)械破碎 細(xì)菌 溶菌酶水解肽聚糖破壁 培養(yǎng)細(xì)胞 去污劑與蛋白酶破膜 破膜用去污劑 ? SDS C12H25OSO3 Na＋ % 終濃度 [Na+] ≧1 M SDS↓ 影響 CsCl 梯度 ? Sar
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