【正文】 本 文 對(duì)由日本槍烏賊 （ Loligo Japonica） 的魚骨 制備 β殼聚糖的工藝進(jìn)行了研究和改進(jìn)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了全面表征，包括元素分析、 FTIR、 HPLC、XRD、 NMR和 AFS 等技術(shù)手段。殼聚糖胺代衍生物 具有 多項(xiàng)優(yōu)異的生物活性，能使抗病毒效果在綜合作用下發(fā)揮最大，且制備簡單，原材料豐富，作為藥物使用能有效降低毒副作用及相關(guān)生物污染。 表 32 不同濃度 NPC、 6BrNPC 生理鹽水溶液的抗新城疫病毒效果研究 濃度 治愈率 (%) 化合物名稱 g/L L g/L 1 g/L 5 g/L 8 g/L 10 g/L NPC 0 0 0 100 100 100 100 6BrNPC 0 0 80 100 100 100 100 10g/L的 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?10g/L的 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶侨芤耗苡行Ы档筒《镜难r(jià)，使病毒效價(jià)由無藥物治療組的 11 降低至 0。 85 ℃ 加熱 5min 失活TransScript RT與 gDNA Remover C） 熒光定量 PCR：采用 PCR試劑盒，按要求取 8μLtemplate，上下游引物各 1μL， 10μL 2TransStart Top Green qPCR SuperMix設(shè)置步驟為 ① 94℃ 30sec，循環(huán)數(shù)為 1。 72h后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。 72h 后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。 C)不同溶劑中 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 直接抑制新城疫 病毒活性研究 分別將 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶牵?NPC）和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?(6BrNPC)、 6氨乙胺基 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶牵?6ANPC）、 6胺取代 6脫氧殼聚糖（ 6AC）配置成 1g/L、 5g/L、 10g/L 的生理鹽水（ N）、 PBS（ P）、二甲亞砜（ D）溶解液，抽濾除菌后，備用。 Top Green qRTPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司） ； 病毒（ LASOTA 雞新城疫病毒，原始病毒效價(jià)為 211， 96h 內(nèi) 致雞胚死亡） ； 儀器 Nicolet TM iSTM10 傅立葉變換紅外光譜儀（ Thermo， USA）； SHZD（ III）型循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪豫華儀器廠）； FD1A50 型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）； SARTORIUS 精密分析天平（德國 SARTORIUS 公司）； HitechKflow純化水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）； Anke GL20911 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； DHG9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ IKA RV/HB digital） ； 試驗(yàn)方法 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 的制備 [77] A） N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶堑闹苽?（ NPC） 稱取 3g殼聚糖 于三口燒瓶中， 加入 60mL 二甲基甲酰胺（ 含 5%的 水） ， 均勻 溶散后 加 入 8g鄰苯二甲 酸酐， 120℃ 攪拌回流 8h，反應(yīng)物傾倒于 冷水中減壓過濾 ，洗滌烘干后 得 棕色粉末狀固體。直接抑制病毒的最佳分子量段為 104kDa；預(yù)防作用組的最佳分子量段為 8kDa3kDa。 摘要 21 圖 25 高濃度低分子量 α殼聚糖預(yù)防作用 取血凝試驗(yàn)中，抗病毒效果最好的低濃度的分子量為 4513Da 的 α殼聚糖處理后雞胚尿囊液為實(shí)驗(yàn)原料， 進(jìn)行熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)病毒本身的RNA 并未降低，但 IL TNFα等免疫相關(guān)因子 RNA 顯著增多 。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 隨著分子量的降低， α殼聚糖的抗病毒效果呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì) ， 當(dāng)分子量在 4kDa10kDa 時(shí)， α 殼聚糖表現(xiàn)出較好的 抗新城疫病毒的效果 ，且分子量為 4513Da 時(shí)效果 最為 顯著。分別為 10μL2TS Reaction Mix， 1μLTransScript RT/RI Enzyme Mix，1μLgDNA Remover，輕輕混勻， 42℃ 孵育 30min。每隔 8 小時(shí)觀察雞胚存活情況，將 24h內(nèi)死亡雞胚致謝 剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時(shí)抽取進(jìn)行血 凝試驗(yàn)。 C2)預(yù)防作用 ： 將不同濃度藥物注射雞胚尿囊腔， 3h后接 種 新城疫病毒，72 小時(shí)后收取尿囊液，測定其血凝效價(jià)。抽濾除菌后，備用。將 LASOTA雞新城疫 病毒用生理鹽水 稀釋為 106 后，以 1:1 的比例按照分子量由大到小順序依次與低分子量 α殼聚糖混勻，編號(hào)為 18 組，備用。將 50mL 溶解后的 α殼聚糖倒入 100mL 微波反應(yīng)器中，加入 30%過氧化氫 ， 600W， 70℃ 條件下，攪拌 500 r/min， 依次反應(yīng) 10min、 15min、20 min、 25min、 30min、 40min、 60min、 80 min、 100min、 180min， 將獲得的溶液透析、凍干并進(jìn)行分子量及結(jié)構(gòu)的測定。 致謝 第二章 不同 分子量 α殼聚糖 的 制備 及 其 抗新城疫病毒 活性 研究 傳統(tǒng)的抗病毒藥物往往存在毒副作用大或是交叉產(chǎn)生病毒抗藥性等特點(diǎn)，因此 ， 亟待開發(fā)毒副作用小、抗病毒活性好的新型抗病毒藥物 [74]。 然而，由于病毒的變異性及疫苗本身及接種程序所存在的 問題 ，導(dǎo)致目前主要的防治 新城疫的手段 ——疫苗接種，面臨極大的考驗(yàn)。致謝 VERCELLOTTI 和 SHARON 等人發(fā)現(xiàn)殼聚糖磺化衍生物能抑制哺乳動(dòng)物病 毒感染 ， 同時(shí)也能抑制勞舍氏白血病病毒和單純皰疹病 毒 I 和 II[69]。殼聚糖 對(duì)植物病毒種類沒有明確的局限性 [64, 65]，而與自身的 分子量、聚合度、濃度 等 有關(guān)。 多糖是生命有機(jī)體的重要組分，并在控制細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長以及維持生命有機(jī) 體正常代謝等方面具有重要作用 ，主要影響免疫系統(tǒng)中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、巨噬細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞及白細(xì)胞，促成RNA、 DNA、蛋白質(zhì)的合成、抗體的生成、補(bǔ)體的生成以 及對(duì)干擾素的作用，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，使抗病毒能力增強(qiáng)， 從而達(dá)到抗衰老、抗放射線、抗腫瘤以及抗肝炎等目的 [59] [60]。 殼聚糖分子內(nèi) 2 位氨基和 6 位羥基是化學(xué)修飾的主要位點(diǎn)， 具有很好的 反應(yīng)性能 ，可與過渡金屬、稀土金屬進(jìn)行配 位 [50]， 經(jīng) 化學(xué)修飾 后 能產(chǎn)生與抗血栓形成、細(xì)胞活性、抗腫瘤活性和血液相容性等生物學(xué)潛能，可應(yīng)用于醫(yī)藥材料的生產(chǎn) [36, 51]。研究發(fā)現(xiàn)， 殼聚糖脫乙酰度達(dá) 97%時(shí)，能有效增加其對(duì)活性 FM 黑的吸附性能 [44]。 隨著脫乙酰度的增大，氨基作用的增強(qiáng)，殼聚糖的生物活性隨之增強(qiáng)。目前研究最為豐富的一類為 α甲殼素，為反平行結(jié)構(gòu)，由于其良好的組織相容性、生物低毒性和結(jié)構(gòu)可修飾性等特點(diǎn)，作為基礎(chǔ)材料廣泛應(yīng)用于紡織、印染、 食品、醫(yī)藥、化工等多個(gè)領(lǐng)域 [31, 32]。其主要原因有母源抗體的干擾、病毒引起的免疫抑制、免疫程序不科學(xué)、免疫 方法不恰當(dāng)和疫苗質(zhì)量參差不齊等 [1921]。 HN 糖蛋白在病毒侵染過程中 ， 可 識(shí)別細(xì)胞受體 ， 介導(dǎo)病毒吸附于細(xì)胞膜， F 蛋白參與病毒的穿透、細(xì)胞融合和溶血等過程，是決定 NDV致病性的主要因素。僅 20xx 年，發(fā)病家禽就高達(dá) 168 萬只，給我國經(jīng)濟(jì)造成重大損失，是危害養(yǎng)雞 業(yè)健康發(fā)展的三大主要疫?。u馬立克氏病，雞新城疫，雞 傳染性法氏囊?。┲?[7]。經(jīng)胺 取 代修飾的 殼聚糖衍生物雖然 具有顯著 的抗新城疫病毒效果，但 對(duì)于免疫因子 轉(zhuǎn)錄 影響表現(xiàn)獨(dú)特 ，有效降低了病毒 RNA。目前 針對(duì)雞新城疫病毒 主要采用疫苗方法， 以預(yù)防為主 。 邢老師 以其熱情開朗的生活態(tài)度 、嚴(yán)謹(jǐn)客觀的研究認(rèn)識(shí)、 努力認(rèn)真的工作作風(fēng) 深深影響著我。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。 （保密論文在解密后適用本授權(quán)書） 學(xué)位論文作者簽字： 日期： 導(dǎo)師簽字： 日期： 摘要 3 The preparation of chitosan and its derivatives and their inhibition effect on Newcastle disease virus By He Xiaofei (Marine Pharmacology) Directed by Xing Ronge A Dissertation Submitted to The University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Master of Science Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences May, 20xx 致謝 致謝 時(shí)光匆 匆而逝，三年好似昨天。 感謝羅豐雷 師姐 、鄒平 師姐 、 楊皓月 師姐 、王晶 師姐 、 李儼 師兄 、宋琳 師姐 、張恩惠 師兄 、周苗苗、岳洋、黃勇 師弟 、張曉倩 師妹 、劉衛(wèi)翔 師弟 、金秋師妹 、孫 雨 豪 師弟 、楊 悅 師妹 等實(shí)驗(yàn)室兄弟姐妹們給予的支持與幫助 ， 在此 一并 表示感謝。 具體結(jié)果如下： 測試樣品均具有抗新城疫病毒活性，分子量、分子結(jié)構(gòu) 、 修飾基團(tuán) 、產(chǎn)品濃度和接種方式 對(duì)活性影響顯著。 2) βchitosan’s antiviral activity is superior to αchitosan. βchitosan with 3KDa6KDa Mw effectively reduced blood clotting titer to 0 in the direct inhibiting virus group. 3) 6deoxidationNphthalic acyl chitosan and 6deoxidation6bromineNphthalic acyl chitosan significantly improve the antiviral activity in direct inhibiting virus group which reduce blood clotting titer to 0. 4) In terms of concentration, 8 g/L 3624Da and 2 g/L 5743Da βchitosan and 1 g/L 6deoxidationNphthalic acyl chitosan and 6致謝 deoxidation6bromineNphthalic acyl chitosan dropped the hemagglutination titer of NDV to zero. Results from fluorescence quantitative PCR showed that both αchitosan and βchitosan effectively increased the transcription of immune factors such as IL2, IFNβ, TNFα, IFNα, while not lead to a sharp decline in viral RNA. Although amine modified chitosan derivatives have significant effect on NDV, the transcription of immune factors performed specially, which reduced the viral RNA effectively. Therefore, we thought that the antiviral mechanism of βchitosan and 6amine6 deoxidization chitosan should be different which worth further research. This article made a road lead to obtain a green, inexpensive and effective drug against NDV. At the same time, it also made an important foundation for the systemic research of the treatment of other immune injury disease. KEY WORD βchitosan with different molecular weight αchitosan with different molec