【正文】 ular weight 6amine6deoxidation chitosan Newcastle disease Virus Antiviral mechanism 摘要 5 第一章 緒論 新城疫病毒的介紹及防治現(xiàn)狀 新城疫 是由新城疫病毒（ NDV）引起禽類的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型癥狀的高度接觸性、急性敗血性傳染 病 [1, 2]。 通過(guò)局部反應(yīng)產(chǎn)生特異抗體，由腺管上皮細(xì)胞以頂漿分泌方式排至腺管，集 成淚液。 通常藥物并不能中斷病毒感染，因此預(yù)防措施 就顯得尤為重要 [17]。 摘要 7 圖 11 病毒入侵機(jī)體刺激免疫細(xì)胞反應(yīng) 甲殼素和殼聚糖 概述 甲殼素是世界上第二大纖維素資源， 存在于蝦、蟹、霉菌、酵母、蘑菇等菌類的細(xì)胞壁及甲殼類昆蟲(chóng)的外骨骼等 [26, 27]，年產(chǎn)可達(dá) 10 億噸以上 ，是一種環(huán)境友好型的可再生天然高分子材料 。由于分子鏈中胺基和羥基的存在，使吞噬 細(xì)胞 致謝 其 反應(yīng)活性極大 增強(qiáng)， 具有 良好的成膜性、絮凝性等機(jī)械性能，能夠 抑菌、抗癌、增強(qiáng)免疫，且具有細(xì)胞親和性、組織相容性和生物可降解性 [39]。 經(jīng)過(guò)脫乙酰反應(yīng) 的 殼聚糖 在 溶解度和 生物 活性 的釋放 上 均 有所 增強(qiáng) ， 根據(jù)脫乙酰度不同可將殼聚糖分為高（ 8595%）、中（ 7085%）、低（ 5570%）三類 [43]。分子量是影響 κ卡拉膠抗流感病毒活性的重要因素之一，平均分 子量在 2kDa 左右的 κ卡拉膠寡糖具有最顯著的抗甲型 H1N1 流感病毒作用。 殼聚糖骨架上 引入更多的 氨基 基團(tuán)，即更多的生物活性反應(yīng)位點(diǎn)和更多的化學(xué)修飾位點(diǎn)， 可改變整個(gè)分子的 PKa，使基團(tuán)更容易帶 正電荷，從而更好發(fā)揮抗菌、抗病毒等生物活性。 巨噬細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，與輔助 T細(xì)胞聯(lián)系后，啟動(dòng)體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng) [66]。 海帶多糖和大部分的海藻多糖等都具有免疫調(diào) 節(jié)作用 [67]，海藻細(xì)胞壁中的多聚硫酸脂多糖能阻止小鼠自身免疫系統(tǒng)腦脊 髓炎的發(fā)生；鈍頂螺旋藻多糖可提高病人殺傷細(xì)胞的細(xì)胞活性；寡褐藻膠，寡 幾丁質(zhì)等寡聚糖片段能在病原侵入時(shí)啟動(dòng)植物的防御機(jī)制，誘導(dǎo)植物自身抗性 基因的表達(dá)，達(dá)到防御植物病害的目的，多種海洋多糖已被制成藥物和保健品 出現(xiàn)在市場(chǎng)上 [68]。因此， 人類 與病毒性疾病的戰(zhàn)役，已經(jīng)不能 只 簡(jiǎn)單的 進(jìn)行 被動(dòng)抵抗了，而必須進(jìn)行強(qiáng)有力的反擊。 海洋生物多糖殼聚糖，其分子中含有正電性的 氨基，摘要 13 具有非常好的生理活性，如調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤 、抗菌、保濕性等，且研究發(fā)現(xiàn)，其可抑制幾十種植物病毒、類病毒的侵染 。 OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix， 北京全式金生物技術(shù)有限公司 ） ； 摘要 15 熒光定量試劑盒 （ TransStart174。 注： SPF 胚對(duì)病毒相對(duì)敏感，對(duì)藥物的耐受也更為敏感 ，雖然 96 小時(shí)內(nèi)完全成活，但繼續(xù)培養(yǎng)至出殼，有狀態(tài)不佳未能 成活，但孵育率為 86%，在 70%可靠值以上。每隔 8 小時(shí)觀察雞胚存活情況，將 24h內(nèi)死亡雞胚剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時(shí) 抽取進(jìn)行血凝試驗(yàn)。蠟封，避免感染，放置于 37℃ 孵育箱孵育 72h。同時(shí)將空白組注射生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照為 10g/L利巴韋林，陰性對(duì)照為生理鹽水。傾倒離心管上清，將管口向下置于吸水紙上，停留 510s，沿離心管壁加入冷乙醇（ 75%） 1000μL，沖洗 12 次。 圖 21 分子量為 4513Da 的 α殼聚糖的高效液相色譜圖。 對(duì) 10g/L高濃度的殼聚糖溶解過(guò)程中，由于低分子量殼聚糖中， 5kDa 以上的 α殼聚糖不能達(dá)到完全溶解，因此我們添加 1%的乙酸促進(jìn)溶解。 本章小結(jié) 采用 過(guò)氧化氫輔助微波降解殼聚糖的方法制備 不同分子量 的殼聚糖，并以不同濃度的低分子量 α殼聚糖作為實(shí)驗(yàn)原料，系統(tǒng)化的研究了分子量對(duì) α殼聚致謝 糖抗新城疫病毒效果的影響。我們對(duì)制備 過(guò)程中 一系列的 中間產(chǎn)物 也 一并進(jìn)行了抗 新城疫 病毒活性篩選 ，希望 在更大范圍內(nèi)尋找 抑制新城疫病毒的可能 的 獸藥 前體 。醇沉 離心后冷凍干燥 的棕 色固體。陰性對(duì)照為 106 雞新城疫病毒與生理鹽水 1:1 混合液。陰性對(duì)照為 106 雞新城疫病毒與生理鹽水 1:1 混合液。低速離心，將槍頭置于核酸相反的位置吸出殘余液體。以病毒血凝效價(jià) ≤7為可治愈率，結(jié)果如下表： 摘要 29 表 31 不同溶劑中 6胺代 6脫氧殼聚糖的抗新城疫病毒效果研究 化合物名稱 治愈率 濃度 NPC（ %） 6BrNPC（ %） 6ANPC（ %） 6AC（ %） 黃芪多糖 N P D N P D N P D N P D 10g/L 100 75 20 100 0 60 0 20 20 0 0 0 0 5g/L 100 40 40 100 0 20 0 0 0 0 20 0 20 1g/L 60 0 20 100 0 40 0 0 0 0 0 0 0 結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖胺代衍生物中 N鄰苯二甲酰基殼聚糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?，能有效降低雞胚尿囊液中的新城疫病毒血凝效價(jià)，使病毒效價(jià)由無(wú)藥物治療組的 11 降低至 0，治愈率可達(dá) 100%。經(jīng)過(guò)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， N鄰苯二甲?；鶜ぞ?糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖能有效降低尿囊液中病毒 RNA含量。 通常 β殼聚糖較 α殼聚糖 具有相對(duì)弱的 分子間作用力 ， 因而 溶解性、反應(yīng)活性和對(duì)溶劑的親和性 更好 [79]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明 β殼聚糖具有明顯優(yōu)于 α殼聚糖的抗病毒活性，可開(kāi) 發(fā)成抗病毒類獸藥。 然而，魷魚(yú)骨 卻是重要的 海洋資源 ——β殼聚糖的主要來(lái)源 [78]。 本文 采用不同溶劑溶解殼聚糖胺代衍生物，對(duì)不同溶劑對(duì)生物活性的釋放影響進(jìn)行了評(píng)估，并最終采用生理鹽水作為有效溶劑對(duì)殼聚糖胺代衍生物進(jìn)行溶解釋放，發(fā)現(xiàn)其對(duì)新城疫病毒具有很好的抑制作用。 致謝 圖 31 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶牵?NPC）和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?6BrNPC)的紅外譜圖。 120xxr/min 離心 10min。 取 911 日齡 SPF 雞胚，用照蛋器觀察雞胚存活情況并畫(huà)出氣室，確定打孔摘要 27 位置。采用 碘酊 對(duì)雞胚氣室外殼進(jìn)行消毒后，再用 75%酒精消毒，打孔器打孔后注射 112 組溶液 。反復(fù)洗滌后固體冷凍干燥 ，得 灰白 色 固體 。因此， 我們希望通過(guò)氨基基團(tuán)的引入，增加殼聚糖 上 活性氨基的 數(shù)量 ，從而提高殼聚糖的結(jié)合 活性 和反應(yīng)性能，探討殼聚糖活性開(kāi)發(fā)的 另一 可行性途徑。 因此我們進(jìn)一步確定了最佳的分子量在 5kDa 左右的 α殼聚糖具有相對(duì)較好的抗病毒綜合效果，作為我們今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。但是在更小的分子量組分中，并沒(méi)有 出現(xiàn) 抗病毒效果的繼續(xù)優(yōu)化，反而略有下降，可能抗病毒效果不僅與分子量大小有關(guān)系，更與降解后小片段的多糖結(jié)構(gòu)等有致謝 關(guān)。 結(jié)果與討論 α 殼聚糖 的制備及表征 通過(guò)紅外表征及分子量的測(cè)定證明通過(guò)微波輔助方法，我們成功制得了分子量分別為 992 837 451 276 262 239 196 1729Da 的 α殼聚糖 ，且由紅外譜圖可以發(fā)現(xiàn)，微波輻射對(duì)不同分子量 α 殼聚糖 的結(jié)構(gòu) 沒(méi)有破壞 。 120xxr/min離心 10min，分管取上清液 600μL，加異丙醇 800μL，顛倒混勻， 20℃ ，沉淀 30min。 取 911 日齡 SPF 雞胚，用照蛋器觀察雞胚存活情況并畫(huà)出氣室 ，確定打孔位置。采用碘伏對(duì)雞胚氣室外殼進(jìn)行消毒后， 再用 75%酒精消毒，打孔器打孔后注射 18 組溶液 。同時(shí)將空白組注射生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照為 1g/L利巴韋林與病毒 1:1 混合液，陰性對(duì)照為 106 雞新城疫病毒與生理鹽水 1:1 混合液。 低分子量 α殼聚糖抗新城疫病毒效果研究 [1, 73, 76] A) 新城疫病毒毒力測(cè)定 EID50的測(cè)定： 取雞胚 30 枚，分 6 組，分別注射 10 10 10 10 10 109病毒原液 生理鹽水稀釋液 ， 37℃ 孵育 72 小時(shí)后收取尿囊液，測(cè)定 EID50=，取 150EID50≈ 106 為 病毒注射量。本文采用過(guò)氧化氫微波輔助方法，降解α殼聚糖分子量在 1kDa10kDa 之間，并采用雞胚實(shí)驗(yàn)及相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)，測(cè)定新城疫病毒血凝效價(jià)的變化及經(jīng)過(guò)治療后的雞胚尿囊液中免疫因子 IL TLRIFNα/β及 TNFα的變化 ， 對(duì)殼聚糖 影響 新城疫 病毒的 RNA 含量也進(jìn)行了測(cè)定 。 海洋藥物已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。 研究的內(nèi)容 、 目的和意義 近年來(lái)，由于環(huán)境污染及病毒基因組的變異性 ，許多前所未聞的病毒進(jìn)入人們的視野，引起恐慌。 殼聚糖衍生物作為抗病毒首要的開(kāi)發(fā)前景 海洋多糖來(lái)源豐富， 由于生長(zhǎng)環(huán)境不同， 海洋動(dòng)物、海洋植物以及海洋微生物都能合成出不同于陸地植物的帶有大量電 荷、含有糖醛酸及硫酸酯的多糖。殼聚糖作為單獨(dú)的抗病毒藥物可抑制幾十種植物病毒、類病毒的侵染，如對(duì)大豆花葉病毒和煙草花葉病毒，并對(duì)植物病毒種類沒(méi)有明確的局限性 [64, 65]，但與殼聚糖的分子量、聚合度、濃度及植物宿主種類有關(guān)。 殼聚糖的生物活性與 2 位氨基 有著尤其緊密的關(guān)系。 高粘度的殼聚糖具有污水處理 、捕集重金屬及酶與細(xì)胞 固定化 等 作用 ；中粘度的殼聚糖， 主要用于紡織、印染、膠合劑；而低粘度的殼聚 糖則不僅在工業(yè)、食品 包裝方面應(yīng)用廣泛，且可作為口服抗酸劑，緩解胃酸， 控制人體膽固醇的吸收及制備多種藥劑 、 藥膏 [27, 46]。 因此 脫乙酰 化 和分子量的調(diào)整成為殼聚糖開(kāi)發(fā)應(yīng)用中 重要的 改性 [28]。 然而 由于甲殼素 分子內(nèi)及分子間 較強(qiáng)的氫鍵作用，使得甲殼素結(jié)構(gòu)緊密 [31]，不溶于 水和大多數(shù)的有機(jī)溶劑，因此應(yīng)用受到限制 [37]。干擾素只能 在感染病毒的早期使用，而且需要反復(fù)使用；阿昔洛韋容易對(duì)動(dòng)物腎功能造成 損傷；頭孢拉定則導(dǎo)致動(dòng)物血尿情況 [24]；病毒靈與病毒唑等一些藥物可以抑制普通的 感冒病毒，對(duì)其他病毒效果則不夠理想 [19]。同時(shí)病毒的侵入還破 壞了法氏囊內(nèi)的免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，由于這些免 疫活性細(xì)胞被破壞，當(dāng)用 ND疫苗進(jìn)行免疫時(shí)刺激機(jī)體巨噬細(xì)胞加工抗原、傳 遞信息的能力減少，各種免疫細(xì)胞的減少和功能的降低致使機(jī)體發(fā)生免疫抑制 現(xiàn)象或產(chǎn)生的免疫應(yīng)答減少，不能抵抗新城疫野毒的感染而發(fā)生非典型的新城 疫 [15]。而進(jìn)入第三道防線，特異性免疫階段則分為 免疫器官和免疫細(xì)胞兩部分，雞法氏囊和哈德氏囊是 重要的免疫器官。 關(guān)鍵詞 不同分子量 β殼聚糖 不同分子量 α殼聚糖 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 新城疫病毒 抗病毒機(jī)理 摘要 3 ABSTRACT Newcastle disease (ND) is an acute septic and contact susceptible infectious disease caused by Newcastle disease virus (NDV). It resulted in blooding in respiratory tract and digestive tract mucosa. Currently, the treatments against ND are mainly adopts the prevention methods—— vaccines. In recent years, a large number of studies have shown that marine polysaccharide has antiviral activity and improve the body immunity. Chitosan as an only positively charged natural polysaccharide has terrific biological activities, such as the increase of immunity, antitumor, antibacterial, lipidlowering and moisturizing. What’s more important, chitosan and its derivatives were found that they can inhibit dozens of plant virus and viroid infection. But if it against NDV has not been reported at home and abroad. Therefore, we take chitosan with different molecular weight (Mw), different modified groups and different form as research o