【正文】 EM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 sizes ②不同交聯(lián)劑濃度 表 28 與圖 表明，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的濃度有關(guān)。殼聚糖濃度較大， 納米粒子 間粘連現(xiàn)象嚴(yán)重，造成產(chǎn)物粒徑大。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時(shí)分子較大，最終造成交聯(lián)得到的粒子 粒徑也變大。當(dāng)乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯(lián)固化后形成的納米粒子 粒徑較小，且分布均勻， TEM 成像時(shí)襯度足夠，故磷鎢酸染 色后，仍呈黑色圓球。結(jié)果表明，控制 span80 的用量為油相體積的 3%可以取得粒徑較小的產(chǎn)物。隨著油相體積增加，油包水乳液的油膜增厚，形成的乳滴較穩(wěn)定，且分散均勻，交聯(lián)固化后的產(chǎn)物呈圓球狀。 表 24 油水比對納米粒子 粒徑的影響 Table 24Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles 39。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后分別逐漸滴加 %， 1%， 3%， 5%， 7%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 15 (4)不同殼聚糖濃度的選擇 水相：分別稱取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg 溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度分別為 10 mg/mL， 15 mg/mL， 20 mg/mL， 25 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 (2)不同油水比的選擇 水相：稱取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 500 mg，溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成 20 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 實(shí)驗(yàn)方法 稱取 CS 溶于 2%乙酸溶液中，攪拌使其溶解后備用。其依據(jù)的光學(xué)原理為 Fraunhofer 衍射和 Mie 散射理論，因此相應(yīng)的激光粒度分析儀分為激光衍射式和激光動(dòng)態(tài)散射式兩類。 創(chuàng)新點(diǎn) 通過以 CSNPs 為載體，有效增強(qiáng) SeC 的體外抗腫瘤活性，并顯著縮短 SeC 對 MCF7起作用的時(shí)間。 Alexakis 等制備了小牛胸腺 DNA海藻酸酯 納米粒子 ，外面包覆殼聚糖制成載藥 納米粒子 后經(jīng)過胃腸道時(shí)藥物不被破壞， 60%DNA可以從糞便等排泄物中得到。徐海濤等觀察了殼聚糖 順鉑緩釋 納米粒子 對 C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤內(nèi)化療的療效，結(jié)果表明，殼聚糖 順鉑 納米粒子 毒性小，安全性較高，療效可靠。經(jīng)沙鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性增加，能夠黏附在胃黏膜上。溶劑蒸發(fā)法又稱液中干燥法，常用的溶劑蒸發(fā)法是根據(jù)聚合物與藥物的性質(zhì)制成乳液體系，形成穩(wěn)定乳液后，采用升溫，減壓抽提或連續(xù)攪拌等方法使有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)入連續(xù)相并通過連續(xù)相和空氣的界面蒸發(fā)， 納米粒子 固化，并經(jīng)過處理最終得到載藥 納米粒子 的過程 [32]。 Wang 等在溫和的條件下通過界面聚合法一步制備多糖 多肽復(fù)合空心 納米粒子 。此法是將殼聚糖溶于酸性溶液中，再將藥物溶解或分散于該殼聚糖溶液，加入一定量的交聯(lián)劑，在惰性的熱氣流中噴霧干燥，當(dāng)液體通過蠕動(dòng)泵輸送到噴嘴后，壓縮空氣將液體霧化為小液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個(gè)腔體中，液滴中的酸迅速蒸發(fā)，從而形成殼聚糖含藥納米粒子 [33]。它是利用殼聚糖的活性氨基基團(tuán)與醛類的醛基交聯(lián)，得到一種 Schiff 堿。殼聚糖不與體內(nèi)組織產(chǎn)生異物反應(yīng)，在體內(nèi)被溶菌酶降解為對人體無毒的 N乙 酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖 [29]。由于生物大分子可以從自然界的動(dòng)植物中獲得，生物相容性良好，并且可被生物體內(nèi)的酶降解，毒副作用較小，且分子上帶有 的羥基，氨基，羧基等大量可反應(yīng)的官能團(tuán)，可作為化學(xué)修飾的位點(diǎn)，因此它們作為藥物載體材料具有廣闊的應(yīng)用前景 [25]。因此，尋找生物相容性好，低毒性的納米藥物載體成為了近年來研究的目標(biāo) 。進(jìn)入 21 世紀(jì)，納米技術(shù)迅速發(fā)展，作為一個(gè)多學(xué)科交叉領(lǐng)域，涉及面廣應(yīng)用十分廣泛。 μΜ，說明 SeC 不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞， 對細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。硒代胱氨酸 是胱氨酸分子中 S 被 Se 所取代后的含硒氨基酸 [14]。有機(jī)硒主要包括硒多糖，含硒蛋白質(zhì)，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有機(jī)硒化合物。 1988 年，我國已經(jīng)把硒列為膳食營養(yǎng)素之一。 Selenocystine。暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文 I 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性 的研究 摘 要 硒代胱氨酸 (SeC)是一種天然的含硒氨基酸，研究證明， SeC 作為一種新型高效的抗腫瘤藥物在腫瘤化學(xué)預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要的作用。 crosslinking emulsification。此后，硒與硒化合物的生理作用受到普遍關(guān)注。無機(jī)硒主要包括硒，硒酸鹽 (亞硒酸鈉 ,亞硒酸鋅等 )，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氫，硒化鈉，硒化鉀等）等。在哺乳動(dòng)物組中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸 (SeCys) 和硒代蛋氨酸 (SeMet)。 雖然 SeC 作為抗腫瘤藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是從 Chen 等 [16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SeC 的水溶性與穩(wěn)定性較差， 進(jìn)入 MCF7 細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)間比較長， 36 h 之后才觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，且 72 h 后的 IC50=177。當(dāng)物體達(dá)到納米級后，納米粒子在熱學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)力學(xué)及電化學(xué)方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢 [18]。雖然，納米藥物載體作為載藥系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問題，如生物相容性以及細(xì)胞毒性等。蛋白質(zhì)一般包括如明膠，白蛋白，絲蛋白等物質(zhì)，多糖類一般包括如殼聚糖，海藻酸鈉，環(huán)糊精，果膠等物質(zhì)。它不溶于水和有機(jī)溶劑，但是能溶于 PH 的乙酸（ 13 %）溶液中 [28]。 (1)乳化交聯(lián)法 乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖 納米粒子 的常用方法之一。其操作流程如圖 。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 8 圖 逐層自組裝反應(yīng)流程 (4)界面聚合法 界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水 /油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。 圖 沉淀法反應(yīng)示意圖 (6)其他制備方法 制備殼聚糖 納米粒子 的方法還有很多。 Hejazi 等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖 納米粒子 。 (4)降低藥物的毒副作用，提高療效 載有藥物的殼聚糖 納米粒子 循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對機(jī)體正常組織的毒副作用，同時(shí)由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。殼聚糖屬親水性聚合物，可制得不同大小的 納米粒子 ，將疫苗，蛋白質(zhì)，抗生素類藥物制成 納米粒子 系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長效緩釋靶向的目的。本文通過乳化交聯(lián)法制得殼聚糖 納米粒子 載體負(fù)載硒代胱氨酸，并對 MCF7 進(jìn)行 體外抗腫瘤活性 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能夠增強(qiáng)硒代胱氨酸對 MCF7 的細(xì)胞毒性，并在較短的時(shí)間內(nèi)起作用。激光粒度分析法是根據(jù)激光照射到顆粒后，顆粒能使散射的激光產(chǎn)生衍射或散射的現(xiàn)象來測試粒度分布的。本論文研究中以 TEM 觀察殼聚糖納米材料的結(jié)構(gòu)。（ CSNPs）。（ CSNPs）。（ CSNPs）。隨著油水相體積比增大，水殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 17 相 納米粒子 能夠被較厚的油相膜隔離開，降低了在超聲分散過程中 納米粒子 粘連的幾率，從 PdI和粒徑分布圖看出，油水相體積比增大，粒徑分布更加均勻，粒徑減小。這可能是由于油相體積較小，乳化時(shí)殼聚糖溶液無法形成規(guī)則乳滴，造成交聯(lián)固化后的產(chǎn)物不規(guī)則。隨著乳化劑用量的增加，界面膜厚度和強(qiáng)度逐漸增加，過量會(huì)導(dǎo)致膜層太厚，不容易交聯(lián)，后續(xù)的洗滌也變得困難。這可能是由于乳化劑過少或過多造成乳滴界面膜不穩(wěn)定，表面不均勻，存在凹陷，造成在 TEM 成像時(shí)的襯度太低，以致觀察不到物像，故需要磷鎢酸染色。隨著殼聚糖溶液濃度的增加，產(chǎn)物的粒徑也增加，分散性變差，且顏色加深，由白色逐漸變成棕黃色。殼聚糖濃度較小，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)松散。 sizes No. Glutaraldehyde aq(1%)/ml Size() PdI D1 2 D2 3 D3 4 D4 5 D5 6 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 26 2 3 4 5 604080120160200240280 Size(m)V / m l 圖 不同交聯(lián)劑體積對 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde volume on nanoparticles39。 sizes E 1E 2E 3E 4E 5 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 shapes of different glutaraldehyde concentration (E1) % (E3) 3% (E5) 7% 本章小結(jié) 通過以上實(shí)驗(yàn)，表明乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子受到幾個(gè)因素的影響 ——不同油相體系，油水相比例，表面活性劑用量，殼聚糖濃度以及交聯(lián)劑用量。根據(jù)此條件，進(jìn)行殼聚糖納米粒子的載藥制備。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 29 第三章 殼聚糖納米粒子負(fù)載硒代胱氨酸的制備 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)材料 表 31 實(shí)驗(yàn)試劑 Table31 Reagents used in experiment 試劑名稱 規(guī)格 產(chǎn)地 液體石蠟 AR 天津市化學(xué)試劑公司 Span80 CP 天津市化學(xué)試劑公司 殼聚糖 90 % MW=60000 上海伯奧生物科技有限公司 硒代胱氨酸 AR Sigma 公司 戊二醛 (25%) AR 天津市百世化工有限公司 無水乙醇 AR 天津市百世化工有限公司 石油醚 AR 天津市百世化工有限公司 冰醋酸 AR 天津市百世化工有限公司 實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國 Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為 177。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。 shapes of different CS concentration (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL 交聯(lián)劑用量對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 從表 27 與圖 可以看出當(dāng)交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，改變交聯(lián)劑的體積對殼聚糖納米粒子的影響不呈規(guī)律性分布。 sizes 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 24 C 1C 2C 3C 4 圖 不同殼聚糖濃度的 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。 shapes of different Span80 dosage (B1) 2% (B2) 3% (B4) 5% 殼聚糖濃度對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 26 與圖 是不同殼聚糖濃度對殼聚糖納米粒子粒徑的影響。 sizes 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 21 B 1B 2B 3B 4B 5 圖 不同 Span80 用量 納米粒子 的粒徑分布 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。從表跟圖中可以看出，當(dāng) span80 用量為油相體積的 3%時(shí)，殼聚糖 納米粒子 的粒徑最小。 sizes (A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 (2) TEM 分析 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 19 TEM（ TEANAI10 型透射電子顯微鏡， philips） 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸