【正文】 子量 殼聚糖 及其衍生物對新城疫病毒 抑制 的 系統(tǒng)性 研究 是首要需解決的關(guān)鍵性問題之一 。 新城疫作為 危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的三大主要疫病之一，不 僅給我國的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時由于疫情 的發(fā)展，還極大的影響了旅游等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 殼聚糖具有如抗凝、溶栓、降血糖、抗氧化、 抗腫瘤、抗炎、抗細(xì)菌、抗病毒、抗原蟲等生物活性 ， 能 激活機(jī)體 免疫 系統(tǒng)和介導(dǎo)機(jī)體系統(tǒng)的系列生物學(xué)效應(yīng)，提高吞噬細(xì)胞的系統(tǒng)功能。 巨噬細(xì)胞表面存在著 微生物 多糖的受體， 殼聚糖作為 微生物 多糖的類似物，能刺激巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生如 下反應(yīng)：摘要 11 促進(jìn)其吞噬功能，增強(qiáng)它在其它免疫應(yīng)答中的 協(xié)同效應(yīng)，從而實現(xiàn)機(jī)體對 T細(xì)胞、 NK 細(xì)胞和 B細(xì)胞的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液 免疫應(yīng)答； 此外， 殼聚糖 被認(rèn)為有 干擾 遺傳物質(zhì) 的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄 的功能， 殼聚糖通過誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白，積累次生代謝產(chǎn)物和信號傳導(dǎo)等方 式來達(dá)到抗菌 、抗病毒 的目的。近年 來研究人員不斷探索殼聚糖衍生物的制備，以求提高殼聚糖水溶性、專一性、 高效性，使之廣泛用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品業(yè)、化妝品業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)等，實現(xiàn)產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)。 JE等研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖分子量在 15kDa 時，自由基的清除效果最好 [48]， 而自由基的產(chǎn)生與微生物的感染、免疫、細(xì)胞損傷、生命衰老和腫瘤的發(fā)生 有關(guān) ， 在動物疫病中扮演著 獨(dú)特的角色 [49]。 脫乙酰度高于 95%的殼聚糖，我們 通常 稱之為超高脫乙酰度 的 殼聚糖，在工業(yè)生產(chǎn)中制備困難，適合于殼聚糖高水平的開發(fā)及 利用。 更重要的是， 脫除乙?；蟮募讱に兀芙舛葮O大增強(qiáng)， 能溶于 部分 無機(jī)酸 稀溶液 和 有機(jī)酸 [27]，極大解決了其應(yīng)用的局限性 。這對于 能源緊缺、環(huán)境污染較重的現(xiàn)代社會 而言，具有十分重要的開發(fā)意義 [28]。目前新城疫的防治主要以疫苗預(yù)防為主，由 于價格便宜，免疫時間快，多使用 LASOTA弱毒疫苗，但是 效果不佳。通過鼻淚管到達(dá)鼻腔再進(jìn)入口腔和上呼吸道并保持強(qiáng)烈中和活性而起 到局部免疫作用。 按病毒毒力 可分為強(qiáng) 毒株和 弱毒株 [3]，按臨床表現(xiàn)可分為速發(fā)性嗜內(nèi)臟型、 速發(fā)性嗜肺腦型 、 中發(fā)型新城疫 和 緩發(fā)型新城疫 。 1） α殼聚糖 和 β殼聚糖 抑制新城疫病毒 的最佳分子量分別為 4513Da 和 5743Da； 2） β殼聚糖的抗新城疫病毒活性明顯優(yōu)于α殼聚糖， β殼聚糖 在分子量為 3kDa6kDa 時，在直接抑制病 毒 的 接種 方式 下可有效降低血凝效價至 0，效果非常顯著 ； 3） 6脫氧 N鄰苯二甲酰基殼聚糖和6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?顯著提高了 抗 新城疫 病毒活性 ，在直接抑制病毒的 試驗中 可有效降低血凝效價至 0； 4）在濃度方面， 8g/L分子量為3624Da 和 2g/L 分子量為 5743Da 的 β殼聚糖 ， 1g/L的 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖均能 將 新城疫 病毒 血凝效價 降至 0。 特別感謝奧蘭百特尹燕博老師課題組對抗病毒實驗的支持與指導(dǎo)， 感謝張全斌老師課題組在儀器設(shè)備上的 幫助 與支持 ，也感謝家人一直以來的關(guān)心、支持與體諒。一年的北上求學(xué)，兩年的實驗探索，時至今日 已接近尾聲。摘要 1 密級 :，，， 碩士學(xué)位論文 殼聚糖 衍生物 的制備及 其 抗新城疫病毒 活性 研究 作者姓名 ： 何曉飛 指導(dǎo)教師 : 邢榮娥副研究員 中國科學(xué)院海洋研究所 學(xué)位類別 : 學(xué)術(shù)型碩士 學(xué)科專業(yè) : 海洋藥物學(xué) 培養(yǎng)單位 : 中國科學(xué)院海洋研究所 學(xué)位授予單位： 中國科學(xué)院大學(xué) 20xx 年 05 月 致謝 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。十分感謝三年來，我的指導(dǎo)老師 ——邢榮娥老師，在生活和學(xué)習(xí)上給予的悉心指導(dǎo)與幫助 ，讓我對過去充滿懷念、對現(xiàn)在充滿感恩、 對以后充滿信心 。 學(xué)生 何曉飛摘要 1 摘要 新城疫是由新城疫病毒（ NDV）引起禽類的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型癥狀的高度接觸性、急性敗血性傳染病。 熒光定量 PCR的測定結(jié)果 表明： 低分子量 α殼聚糖 、 β殼聚糖 都能有效增加 IL IFNα、 IFNβ、 TNFα等免疫因子的轉(zhuǎn)錄，但 并沒有 導(dǎo)致病毒 RNA的致謝 明顯下降。 雞新城疫又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，主要特征是 呼吸困難、便稀、神經(jīng)紊亂、粘膜和漿膜出血，死亡率高 ，危害嚴(yán)重 [46]?？梢姷竭_(dá)這些部位的抗體不是血液中循環(huán)抗體的機(jī)械滲透而 是來源于哈德氏腺 ND局部免疫的發(fā)生部位，正是 NDV的入侵門戶 [12]。雖然有多種疫苗和免疫方法，但是該病的發(fā)病率卻仍是居高不下 [10, 18]。 甲殼素的來源不同，構(gòu)型亦有所差異，可分為 α甲殼素、 β甲殼素和 γ甲殼 素 [29, 30]， 結(jié)構(gòu)的不同 導(dǎo)致其性質(zhì)也具有很大的差別。 因此 ， 殼聚糖的脫乙酰度， 也 成為 衡量其生理活性的 重要的技術(shù)指標(biāo)之一 [40]。 目前市售多為 7085%的中脫乙酰度 的 殼聚糖，適合于一般的生產(chǎn)，但 對殼聚糖 活性的不斷開發(fā)和應(yīng)用 則摘要 9 迫切需要 高甚至超高脫乙酰度 的 殼聚糖的 批量 制備。 氨基 和羥基 修飾對殼聚糖活性的影響 殼聚糖和甲殼素的化學(xué)修飾產(chǎn)生新的生物功能材料是目前主要研究領(lǐng)域，在不改變功能骨架的前提下，由于天然基團(tuán)的 引入保持并加強(qiáng)了其物理、生物、化學(xué)性質(zhì) [38]。 殼聚糖 衍生物 抗病毒活性概述 海洋生物多糖從來源上可分為海藻多糖和海洋 動物多糖，目前多種海洋微生物也被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生生物活性多糖 [58]。殼聚糖作為抗病毒藥物的載體的研究已經(jīng)屢見不鮮 [6163]， 而 作為單獨(dú)的抗病毒藥物 ， 可抑 制幾十種植物病毒、類病毒的侵染，如對大豆花葉病毒和煙草花葉病毒。 1958 年， GERBER首次報道了多糖硫酸酯 具有抗病毒活性，能強(qiáng)烈抑制具有包膜的病毒， DEREK HORTON 和 ERNST 殼聚糖氨基 上含有 硫酸根 對白血病病毒具有顯著抑制作用。 雖然目前由于新城疫病毒的多發(fā)性而被我國規(guī) 定為強(qiáng)制免疫病種，在政府組織下進(jìn)行集中免疫 [72]。 因此，我們通過微波方法 及接枝 技術(shù) 制備不同 分子構(gòu)型、不同 分子量的高脫乙酰度殼聚糖 及其胺代衍生物 ， 并以此為 研究對象， 對雞胚尿囊液中血凝效價的降低作用 為指標(biāo) ， 篩選出最佳 分子構(gòu)型、 分子量 及衍生物產(chǎn)品 ；同時，采用熒光定量PCR技術(shù)，測定細(xì)胞因子在分子及蛋白水平的變化 ，以此確定殼聚糖 衍生物 在對抗 新城疫 病毒的過程中，對于免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)控， 從而確定殼聚糖 衍生物 對于機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響及藥效機(jī)制 ， 為殼聚糖硫酸酯成為預(yù)防與治療 新城疫 病毒的藥物打下堅實的理論基礎(chǔ)。 （ LASOTA 雞新城疫病毒，原始病毒效價為 211， 96h 內(nèi)致雞胚死亡） ； 儀器 微波降解反應(yīng)器 （ MASII 型，上海 新儀 微波化學(xué) 科技 有限公司） ； 透析袋（ MEMBRACEL，截留分子量為 500/1000/5000Da） ； 安捷倫 1260 凝膠滲透色 譜 儀 (美國安捷倫科技公司 )； Nicolet TM iSTM10 傅立葉變換紅外光譜儀（ Thermo， USA） ； SHZD（ III）型循環(huán)水式真空泵 （ 河南鞏義市英峪豫華儀器廠 ）； FD1A50 型冷凍干燥機(jī) （ 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司 ） ； SARTORIUS 精密分析天平 （ 德國 SARTORIUS 公司 ） ； HitechKflow純化水系統(tǒng)（ 上海和泰儀器有限公司 ）； Anke GL20911 型高速離心機(jī) （ 上海安亭科學(xué)儀器廠 ）； DHG9030A型 電熱恒溫 鼓風(fēng)干燥箱 （上海精 宏 實驗設(shè)備有限公司 ） ； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ IKA RV/HB digital） ； 實驗方法 α殼聚糖的降解 [75] 稱取 α殼聚糖 12g，分子量為 1160kDa、脫乙酰度為 82%，溶解于 400mL濃度為 2%的冰乙酸溶液（體積濃度），攪拌溶解直至獲 得澄清、均質(zhì)的 α殼聚糖 溶液 。 低濃度直接抑制試驗：分別將分子量為 992 837 451 276 262239 196 1729Da 的 α殼聚糖用生理鹽水配置成 1g/L 的溶液，抽濾除菌后，備用。 高濃度直接抑制試驗：分別將分子量為 992 837 451 276 262239 196 1729 Da 的 α殼聚糖用生理鹽水配置成 10g/L 的溶液，加乙酸促進(jìn)溶解， 使 乙酸 終 濃度為 1%。72h后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。蠟封，避免感染，放置于 37℃ 孵育箱孵育 72h。 B)反轉(zhuǎn)錄：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按要求取上下游引物各 1μL， RNasefree Water 6μL分別加入到各管中， 65℃ 孵育 5min后冰浴 2min，然后再加入其它反應(yīng)組分。 （如果那幾個分子量的都做了譜圖的話，最好組合到一起，都做上） α殼聚糖 對 新城疫病毒 的抑制作用 將注射雞新城疫病毒和不同分子量、不同濃度的 α殼聚糖的 1:1 混合液作為直接抑制病毒組；先注射不同濃度、不同分子量的 α殼聚糖， 3h后接種新城疫病毒的實驗組為預(yù)防作用組。 直接抑制病毒組中低濃度 α殼聚糖表現(xiàn)出比高濃度 α殼聚糖更好的抗新城疫病毒活性，可能是由于高濃度的 α殼聚糖引入乙酸 解決溶解度問題 后反而影響了其抗病毒活性的釋放，或者對機(jī)體造成了一定的損傷。 在不同實驗方式下 ，最佳抗病毒效果出現(xiàn)時，殼聚糖分子量略有不同。 OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司） ； 熒光定量試劑盒（ TransStart174。 B) 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 安全限度測定： 將待實驗的 N鄰苯二甲酰基殼聚糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?、 6氨乙胺基 6脫氧 N鄰苯二甲酰基殼聚糖、 6胺取代 6脫氧殼聚糖配成20g/l、 10g/l、 5g/l的溶液分別注射于 SPF 雞胚尿囊腔中 ， 96 小時內(nèi)完全成活，繼續(xù)培養(yǎng)至出殼，雞胚外觀健康完整，無殘疾。每隔 8 小時觀察雞胚存活情況，將 24h 內(nèi)死亡雞胚剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時抽取進(jìn)行血凝試驗。每隔 8 小時觀察雞胚存活情況，將 24h 內(nèi)死亡雞胚剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時抽取進(jìn)行血凝試驗。分別為 10μL2TS Reaction Mix， 1μLTransScript RT/RI Enzyme Mix，1μLgDNA Remover，輕輕混勻， 42 ℃ 孵育 30min。我們對不同濃度的 N鄰苯二甲酰基殼聚糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶巧睇}水溶解液進(jìn)行了最低有效濃度的測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過 24h充分 溶解后， N鄰苯二甲酰基殼聚糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖的有效釋放量在 1g/L時，即可全部治愈攜帶新城疫病毒的雞胚。這 表明以上兩種物質(zhì)對于機(jī)體的影響可能 與 低分子量 α殼聚糖有所不同， 但 對免疫系統(tǒng) 也有一定的 活 化 效果。此外 ， JUNG等 研究發(fā)現(xiàn) ， 構(gòu)型的不同是影響殼聚糖抗菌活性 [80, 81]和 抗氧化活性 [82]的重要因素 ； β殼聚糖 具有更好的保水性和保 濕 性； %的 β殼聚糖比 %的 α殼聚糖對雞蛋具有更好的保鮮效果 [83]； 同樣條件下， β甲殼素脫除 70%的乙?；枰?1h，而 α甲殼素則需要 6h來實現(xiàn)這一反應(yīng) [84]。證實由堿液方法制備的 β殼聚糖并沒有發(fā)生構(gòu)型的變化，且安全可食用。作為殼聚糖衍生化修飾產(chǎn)物， N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶羌捌滗?