【正文】 β殼聚糖具有不同于α殼聚糖的平行結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其在制備和性質(zhì)的應(yīng)用上，也與 α殼聚糖有著明顯的差別。 （紅外譜圖附全 ， A和 B代表什么寫清楚 ） 我們分別將 NPC、 6BrNPC、 6ANPC 和 6AC 配置成 1g/L、 5g/L、 10g/L的生理鹽水（ N）、 PBS（ P）、二甲亞砜（ D）溶解液，測定其抗新城疫病毒效果。采用 碘酊 對雞胚氣室外殼進行消毒后，再用 75%酒精消毒，打孔 器打孔后注射 16 組溶液 。 D） 6胺取代 6脫氧殼聚糖 的制備 （ 6AC） 稱取 6氨乙胺基 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶? 25mLN甲基 2吡咯烷酮和 25mL 水合肼 （ 80%）中 ， 100℃ 回流 4h。 并努力 提高 低分子量 殼聚糖的溶解度 ， 使其在生理鹽水溶解狀態(tài)下，達到較高的藥效濃度 。摘要 19 且微波輔助方法簡單可行，原料制備方便且不引入化學(xué)有毒物質(zhì)，具有很好的應(yīng)用前景 ，尤其是工業(yè)大范圍應(yīng)用 。采用碘伏對雞胚氣室外殼進行消毒后， 再用 75%酒精消毒，打孔器打孔后注射 18 組溶液 。蠟封，避免感染，放置于 37℃ 孵育箱孵育 72h。 實驗原料 原料 殼聚糖原料（ 青島 云宙生物科技 有限公司 ，脫乙酰度為 82%分子量為1160kDa）； SPF 雞胚 （ 山東無特定病原雞實驗種雞場 ，符合 GB/ 以及國際通用標準 ） ； 試劑 氫氧化鈉 (分析純，天津市達森化工產(chǎn)品銷售公司 )； 乙酸鈉 (優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 )； 冰醋酸 (高效液相色譜，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 )； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （ TransScript174。從艾滋病、禽流感到 埃博拉病毒，每一次 病毒 的出現(xiàn)都給人類社會造成巨大影響， 且 病毒性疾病的發(fā)生與腫瘤 這一醫(yī)療難題 也是息息相關(guān) [71]。 殼聚糖的抗病毒 機制為促進巨噬細胞活性，影響非殺傷性細胞（ NK）活性白介素的分泌， 刺激輔助 T細胞的生長， 這也是其抗癌的主要機理之一 [28]。 據(jù)報道硫酸葡聚糖的抗 HIV病毒活性在相對分子量為10kDa 時達到最大， 10kDa 500kDa 之間保持最大活性 [47]。 殼聚糖為甲殼素脫除部分乙?；漠a(chǎn)物 ，也是目前自然界唯一帶正電荷的天然多糖化合物 [38]， 化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺 (14)2氨基 βD葡萄糖 。 病毒性疾病與細菌性疾病不同，特效療法較少 ， 主要的防治手段 有疫苗、化學(xué)合成藥物 及干擾素 等 [16]。s immune system and its efficacy mechanism. Specific results are as follows: All test samples have antiviral activity against NDV influenced by Mw, modified group, the concentration of the product and the way of vaccination significantly. 1) The best Mw of αchitosan and βchitosan are 4513Da and 5743Da respectively。諄諄教誨、高尚師德學(xué)生永不敢忘，謹此畢業(yè)之際，特向李老師表達學(xué)生深深的感謝之情，望您身體健康，合家歡樂！ 在三年的學(xué)習(xí)生活中，感謝劉松老師、于華華老師、李克成老師、秦玉 坤老師、王雪芹老師、李榮鋒老師、陳曉琳老師給予的極大幫助與指導(dǎo)，在此特別表示感謝。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。 近年來大量研究表明，海洋生物多糖具有抗病毒和提高機體免疫力的活性 。具有分布范圍廣、易感禽類多、經(jīng)濟損失大、影響 國際貿(mào)易等特點 [8]。治療藥物方面，由于 病毒性疾病本身的難治愈性 、易復(fù)發(fā) ， 長期使用藥物易產(chǎn)生耐藥性、成本高等缺點 而限制其應(yīng)用 [22, 23]。 圖 12 甲殼素 /殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu) （這個結(jié)構(gòu)有問題，甲殼素和殼聚糖 可分著附 ，并寫明乙酰度是多少代表甲殼素，多少代表殼聚糖 ） 殼聚糖衍生物 目前大多數(shù)聚合物是合成材料，他們的生物相容性和生物可降解性相比于纖維素、甲殼素、殼聚糖及其衍生物等天然聚合物相比，具有很大的局限性，但是天然材料 的 反應(yīng)性和可加工性 又阻礙著其應(yīng)用與開發(fā) 。 通常的化學(xué)修飾手段有 烷基修飾、羧甲基修飾、硫酸基團修飾等。經(jīng)過衍生化修飾的殼聚糖 ， 一方面 能夠調(diào)控與免疫相關(guān)的輔助細胞的功能活性，如巨噬細胞和粒細胞等 。 近年來 ， 隨著經(jīng)貿(mào)的發(fā)展和交往的頻繁 ， 新城疫病毒的流行又有了新的特征，疫苗免疫尚不完善，抗病毒化 學(xué)藥物 效果不顯著， 導(dǎo)致 至今尚無有效的治療藥物 [73]。 采用高效凝膠排阻色譜對 α殼聚糖降解產(chǎn)物的 平 均分子量（ Mw） 進行分析。將 LASOTA雞新城疫 病毒用生理鹽水 稀釋為 106 后，以 1:1 的比例按照分子量 大小， 依次與 α殼聚糖混勻，編號為 18 組，備用。 72h后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。 這與之前相關(guān)的海洋多糖研究一致 ， 在一定范圍內(nèi)，硫酸化多糖的抗病毒效果隨著分子量降低而增大。 通過血凝試驗測定病毒血凝效價以及熒光定量 PCR方法測定相關(guān)免疫因子的基因表達，證實低分子量段的 α殼聚糖可通過提高體內(nèi)免疫系統(tǒng)的相關(guān)反應(yīng)機制，對新城疫病毒起到良好的抑制作用。將 LASOTA 雞新城疫病毒用生理壓水稀釋為 106 后，以 1:1 的比例與 NPC、 6BrNP、 6ANPC 和 6AC 混勻，編號為 112 組，備用。 熒光定量 PCR分子實驗 ： A） 病毒 RNA 提?。?取 10g/L 的 NPC 和 6BrNPC 處理過的雞胚尿囊液和陰性對照組雞胚尿囊液各 400μL于不同 離心管中，各加 600μL裂解液顛倒混勻后加 400μL氯仿，編號，顛倒混勻（ 10次左右）后放置 20℃ 沉淀 10min。因此，我們選其進行熒光定量 PCR測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與低分子量殼聚糖不同的是注射 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶羌捌滗宕苌镏委熀蟮碾u胚尿囊液中雞新城疫病毒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后 cDNA含量明顯降低，免疫因子中 TLR IL8 降低，IFNβ和 IFNα轉(zhuǎn)錄增加。證實由堿液方法制備的 β殼聚糖并沒有發(fā)生構(gòu)型的變化，且安全可食用。這 表明以上兩種物質(zhì)對于機體的影響可能 與 低分子量 α殼聚糖有所不同， 但 對免疫系統(tǒng) 也有一定的 活 化 效果。分別為 10μL2TS Reaction Mix， 1μLTransScript RT/RI Enzyme Mix，1μLgDNA Remover，輕輕混勻， 42 ℃ 孵育 30min。每隔 8 小時觀察雞胚存活情況，將 24h 內(nèi)死亡雞胚剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時抽取進行血凝試驗。 OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司） ； 熒光定量試劑盒（ TransStart174。 直接抑制病毒組中低濃度 α殼聚糖表現(xiàn)出比高濃度 α殼聚糖更好的抗新城疫病毒活性，可能是由于高濃度的 α殼聚糖引入乙酸 解決溶解度問題 后反而影響了其抗病毒活性的釋放，或者對機體造成了一定的損傷。 B)反轉(zhuǎn)錄：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按要求取上下游引物各 1μL， RNasefree Water 6μL分別加入到各管中， 65℃ 孵育 5min后冰浴 2min，然后再加入其它反應(yīng)組分。72h后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。 低濃度直接抑制試驗：分別將分子量為 992 837 451 276 262239 196 1729Da 的 α殼聚糖用生理鹽水配置成 1g/L 的溶液，抽濾除菌后，備用。 因此，我們通過微波方法 及接枝 技術(shù) 制備不同 分子構(gòu)型、不同 分子量的高脫乙酰度殼聚糖 及其胺代衍生物 ， 并以此為 研究對象， 對雞胚尿囊液中血凝效價的降低作用 為指標 ， 篩選出最佳 分子構(gòu)型、 分子量 及衍生物產(chǎn)品 ；同時，采用熒光定量PCR技術(shù)，測定細胞因子在分子及蛋白水平的變化 ，以此確定殼聚糖 衍生物 在對抗 新城疫 病毒的過程中，對于免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)控， 從而確定殼聚糖 衍生物 對于機體免疫系統(tǒng)的影響及藥效機制 ， 為殼聚糖硫酸酯成為預(yù)防與治療 新城疫 病毒的藥物打下堅實的理論基礎(chǔ)。 1958 年， GERBER首次報道了多糖硫酸酯 具有抗病毒活性，能強烈抑制具有包膜的病毒， DEREK HORTON 和 ERNST 殼聚糖氨基 上含有 硫酸根 對白血病病毒具有顯著抑制作用。 殼聚糖 衍生物 抗病毒活性概述 海洋生物多糖從來源上可分為海藻多糖和海洋 動物多糖，目前多種海洋微生物也被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生生物活性多糖 [58]。 目前市售多為 7085%的中脫乙酰度 的 殼聚糖，適合于一般的生產(chǎn)，但 對殼聚糖 活性的不斷開發(fā)和應(yīng)用 則摘要 9 迫切需要 高甚至超高脫乙酰度 的 殼聚糖的 批量 制備。 甲殼素的來源不同，構(gòu)型亦有所差異，可分為 α甲殼素、 β甲殼素和 γ甲殼 素 [29, 30]， 結(jié)構(gòu)的不同 導(dǎo)致其性質(zhì)也具有很大的差別。可見到達這些部位的抗體不是血液中循環(huán)抗體的機械滲透而 是來源于哈德氏腺 ND局部免疫的發(fā)生部位，正是 NDV的入侵門戶 [12]。 熒光定量 PCR的測定結(jié)果 表明： 低分子量 α殼聚糖 、 β殼聚糖 都能有效增加 IL IFNα、 IFNβ、 TNFα等免疫因子的轉(zhuǎn)錄，但 并沒有 導(dǎo)致病毒 RNA的致謝 明顯下降。十分感謝三年來，我的指導(dǎo)老師 ——邢榮娥老師，在生活和學(xué)習(xí)上給予的悉心指導(dǎo)與幫助 ，讓我對過去充滿懷念、對現(xiàn)在充滿感恩、 對以后充滿信心 。一年的北上求學(xué)，兩年的實驗探索，時至今日 已接近尾聲。 1） α殼聚糖 和 β殼聚糖 抑制新城疫病毒 的最佳分子量分別為 4513Da 和 5743Da； 2） β殼聚糖的抗新城疫病毒活性明顯優(yōu)于α殼聚糖， β殼聚糖 在分子量為 3kDa6kDa 時，在直接抑制病 毒 的 接種 方式 下可有效降低血凝效價至 0，效果非常顯著 ； 3） 6脫氧 N鄰苯二甲酰基殼聚糖和6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?顯著提高了 抗 新城疫 病毒活性 ，在直接抑制病毒的 試驗中 可有效降低血凝效價至 0； 4）在濃度方面， 8g/L分子量為3624Da 和 2g/L 分子量為 5743Da 的 β殼聚糖 ， 1g/L的 6脫氧 N鄰苯二甲酰基殼聚糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶蔷?將 新城疫 病毒 血凝效價 降至 0。通過鼻淚管到達鼻腔再進入口腔和上呼吸道并保持強烈中和活性而起 到局部免疫作用。這對于 能源緊缺、環(huán)境污染較重的現(xiàn)代社會 而言，具有十分重要的開發(fā)意義 [28]。 脫乙酰度高于 95%的殼聚糖，我們 通常 稱之為超高脫乙酰度 的 殼聚糖，在工業(yè)生產(chǎn)中制備困難，適合于殼聚糖高水平的開發(fā)及 利用。近年 來研究人員不斷探索殼聚糖衍生物的制備，以求提高殼聚糖水溶性、專一性、 高效性，使之廣泛用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品業(yè)、化妝品業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)等，實現(xiàn)產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)。 殼聚糖具有如抗凝、溶栓、降血糖、抗氧化、 抗腫瘤、抗炎、抗細菌、抗病毒、抗原蟲等生物活性 ， 能 激活機體 免疫 系統(tǒng)和介導(dǎo)機體系統(tǒng)的系列生物學(xué)效應(yīng)，提高吞噬細胞的系統(tǒng)功能。 目前國內(nèi)外對于 殼聚糖及其衍生物抑制雞新城疫病毒的研究尚未見報道， 不同 分子 構(gòu)型 、 不同 分子量 殼聚糖 及其衍生物對新城疫病毒 抑制 的 系統(tǒng)性 研究 是首要需解決的關(guān)鍵性問題之一 。 C)低分子量 α殼聚糖 抗新城疫病毒 藥效測定 C1)直接抑制：將不同濃度藥物與新城疫病毒混勻 后按照 1:1（ v/v） 的比例接種于雞胚尿囊腔， 72 小時后收取尿囊液，測定其血凝效價。每隔 8 小時觀察雞胚存活情況，將 24h 內(nèi)死亡雞胚剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時 抽取進行血凝試驗。低速離心，將槍頭置于核酸相反的位置吸出殘余液體。然而， 殼聚糖在酸性溶液中能逐漸水解，粘度降低并最終生成葡萄糖胺，所以使 用時應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用 [27]。 實驗原料 原料 殼聚糖原料（青島百誠生化有限公司，脫乙酰度為 82%分子量為 1160kDa）； SPF 雞胚（ 山東無特定病原雞實驗種雞場，符合 GB/ 以及國際通用標準 ） ； 試劑 乙二胺（ 國藥集團化學(xué)試劑有限公司 ）； N溴代 丁二酰亞胺（ 國藥集團化學(xué)試劑有限公司 ）； 三苯基膦（ 國藥集團化學(xué)試劑有限公司 ）； 生理鹽水（ 醫(yī)用 %氯化鈉，不含葡萄糖 ） 磷酸緩沖液 PBS（ ， USA） ； 二甲亞砜 (實驗專用， )； 致謝 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ TransScript174。蠟封，避免感染，放置于 37℃孵育箱孵育 72h。 B） 反轉(zhuǎn)錄：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按要求取上下游引物各 1μL， RNasefree Water 6μL分別加入到各管中， 65℃ 孵育 5min 后冰浴 2min，然后再加入其它反應(yīng)組分。同時 TLR3 和 IL8 降低，而IFNβ、 TFN增加 。雖然高分子量、高脫乙酰度的 β殼聚糖具有極好的吸附性和機械性能，然而，為了增強 β殼聚