【正文】 玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗 40 分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中 （ 25 ℃ ） 進(jìn)行。綜上，選擇 3 %的戊二醛溶液交聯(lián)時(shí)得到的產(chǎn)物粒徑較小，形貌好，且分布均勻。 表 28 交聯(lián)劑濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響 Table 28Effect of G’s concentration on nanoparticles39。也可能是由于隨著交聯(lián)劑體積的增加，交聯(lián)得到的殼聚糖 納米粒子 結(jié)構(gòu)松散，粒徑分布不均勻，在洗滌過(guò)程中，大的粒子聚集沉淀被洗去，剩下粒徑比較小的殼聚糖納米粒子，因此殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的體積無(wú)關(guān)。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)得的平均粒徑大約相符。這可能是由于殼聚糖溶液濃度過(guò)低，水相液滴中所含的殼聚糖量極少，乳化分散后與交聯(lián)劑交聯(lián)得到的粒子結(jié)構(gòu)松散，不致密，因此粒徑較大。結(jié)果與納米粒度儀測(cè)殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 22 得的平均粒徑大約相符。乳化劑的加入，可以在油水界面上形成一層界面膜，降低乳滴的表面能，減少 納米粒子 粘連的幾率。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)油水比較小時(shí)，得到的粒徑較小，但是形貌不規(guī)則。從表跟圖中可以看出，粒子粒徑在油相體積較小時(shí)粒徑隨油相體積增加而增加，當(dāng)油相體積增加到一定量時(shí)，則隨著油相體積的增加而減少。 油相：量取液體石蠟 25 mL，加入占其體積 3% ( g)的 Span80,攪拌均勻后備用。 油相：量取液體石蠟 25 mL，加入占其體積 2%， 3%， 4%， 5%， 6%的 Span80， 攪拌均勻后備用。 油相：分別 選用液體石蠟 ，甲苯各 25 mL，加入占其體積 5%( g)的 Span80,攪拌均勻后備用。 (2) 透射電子顯微鏡 透射電子顯微鏡（ Transmission electron microscope， TEM），型號(hào) TEANAI10 型透射電子顯微鏡 philips，或高分辨透射電子顯微鏡 （ High resolution transmission electron microscope， HRTEM)，它是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。測(cè)量溫度 ( 177。 但是研究表明， SeC 不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。 (6)提高藥物的穩(wěn)定性 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因重組肽和蛋白質(zhì)藥物不斷涌現(xiàn)，應(yīng)用于臨床的種類(lèi)也越來(lái)越多。 (3)增加藥物的靶向性 殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過(guò)控制殼聚糖 納米粒子 的大小，形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖 納米粒子 的靶向效果。它的應(yīng)用主要有以下幾方面： (1)作為藥物載體，可包埋多種類(lèi)型藥物 殼聚糖 納米粒子 由于其良好的生物相容性，生物降解性和低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于藥物載體方面。另一種操作方法為：在殼聚糖溶液中加入表面活性劑，然后再逐滴加入硫酸鈉溶液，攪拌或超聲 30 分鐘后，離心分離出產(chǎn)物。通過(guò)限制溶質(zhì)沉降次數(shù)可控制空心 納米粒子 的球殼厚度，除去 納米粒子 中的核物質(zhì)即可獲得所需的空心結(jié)構(gòu)。 圖 殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)方程式 C h i t os a n a qu e ou s s ol u t i onO il ph a s eE m u ls if ic a ti on ( W /O) e m u ls io nHa r de n in g of dr ople tsS e pa r a ti on of pa r ti c le sS ti r or U lt r a s ou n dC r os s li n kin ga g e n t 圖 乳化交聯(lián)法操作流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 7 采用乳化交聯(lián)法，可以通過(guò)控制含水液滴的大小來(lái)控制 納米粒子 的粒徑，最終產(chǎn)物納米粒子 的粒徑也取決于在形成乳液時(shí)的油相比，交聯(lián)程度等。近幾年殼聚糖 納米粒子 的 制備和應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn) [31]。 圖 殼聚糖與甲殼素的結(jié)構(gòu) (A) 甲殼素 (B)殼聚糖 殼聚糖的每個(gè) C6 單元均含有一個(gè)氨基，兩個(gè)自由羥基。近年來(lái)，生物大分子材料由于其可再生性，無(wú)毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等優(yōu)點(diǎn)成為藥物載體研究的熱點(diǎn)，于是利用生物大分子材料來(lái)制備納米藥物載體的研究應(yīng)運(yùn)而生。 納米藥物載體的研究進(jìn)展 理想的納米粒載體應(yīng)是無(wú)毒和可生物 的。所謂納米技術(shù)則是指 nm 內(nèi)的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)的構(gòu)造技術(shù)，即納米級(jí)材料的設(shè)計(jì)，制造，測(cè)量和控制技術(shù) [17]。因此， SeC 具有更廣譜高效的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。從此有機(jī)硒化合物的研究引起了廣泛關(guān)注， Shahd 等人在 20xx 年報(bào)道了有機(jī)硒化合物 Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治療子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌 [13]。近年來(lái)，硒與硒化合物的抗腫瘤活性受到普遍關(guān)注，人們一直致力于設(shè)計(jì)和改造含硒化合物，以尋找抗腫瘤活性強(qiáng)，抗腫瘤譜廣，毒副作用低，適用于臨床的含硒抗腫瘤藥物 [1]。 1973 年， Rotruck 等人發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 GSHPx 的活性成分后 [3]，已經(jīng)陸續(xù)有 25 種含硒蛋白被發(fā)現(xiàn)。最后通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，表明以殼聚糖 納米粒子 為藥物載體能夠增強(qiáng) SeC 對(duì) MCF7 乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，并增強(qiáng)其 體外抗腫瘤活性 。高分子載藥 納米粒子 是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新劑型，藥物經(jīng)其包裹后，不僅可以提高藥物穩(wěn)定性，而且還可以大大提高藥物的生物利用率。 1817 年，硒由瑞典學(xué)者 Berzelius 發(fā)現(xiàn)，并命名為 Selenium。硒可以保護(hù)心臟、肝臟等免受損傷，對(duì)癌癥、心血管疾病、艾滋病等起到治療和控制作用 [57]。無(wú)機(jī)硒具有較好的抗癌活性，但無(wú)機(jī)硒化合物脂溶性差，不易進(jìn)入細(xì)胞，且具有蓄積毒性和致突變作用，限制了它在臨床上的應(yīng)用。 圖 硒代胱氨酸的結(jié)構(gòu)式 硒代胱氨酸的抗癌作用 SeC，是一種天然存在的含硒氨基酸，在化學(xué)預(yù)防與治療方面具有巨大的潛力。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 3 納米藥物載體在腫瘤治療中的應(yīng)用 納米技術(shù)的研究進(jìn)展 早在 1959 年，著名物理諾貝爾獎(jiǎng)獲得者 Feynman 就預(yù)言了納米科技的出現(xiàn)及前景。隨著納米技術(shù)向醫(yī)學(xué)界不斷滲透，納米技術(shù)在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用，特別在腫瘤的診斷和治療方面，受到了廣泛的關(guān)注 [17]。合成聚合物主要有聚乳酸（ PLA）、聚乙醇酸（ PGA）、聚乳酸共聚乙醇酸（ PLGA）、聚已內(nèi)酯（ PCL）、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐等。在自然界中，殼聚糖廣泛存在于低等植物菌類(lèi)，藻類(lèi)的細(xì)胞，節(jié)肢動(dòng)物蝦，蟹，蠅蛆和昆蟲(chóng)的外殼，貝類(lèi)，軟體動(dòng)物（如魷魚(yú)，烏賊）的外殼殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 5 和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，每年生物合成的資源量高大 100 億 t，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源 [26]。 殼聚糖 納米粒子 的制備 殼聚糖緩釋體系主要分為：殼聚糖納米粒子，殼聚糖 微球 ，殼聚糖緩釋片，殼聚糖緩釋膜，殼聚糖緩釋凝膠 5 種類(lèi)型 [26]。此法是將殼聚糖溶液加入含有表面活性劑的油相中形成 W/O 型乳劑，再加入一定量的交聯(lián)劑如戊二醛，甲醛，三聚磷酸鹽，檸檬酸鹽，硫酸鹽和京尼平等進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固化，通過(guò)離心純化即可制得殼聚糖 納米粒子 [33]。 He 等 [35]將配置好的殼聚糖水溶液與一定比例的戊二醛水溶液混合均勻，然后進(jìn)行噴霧干燥，制備出的殼聚糖 納米粒子 粒徑在 312 μm之間。 圖 界面聚合法反應(yīng)流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 9 (5)沉淀法 沉淀法是利用殼聚糖不溶于堿性溶液的性質(zhì)制備 納米粒子 。 Sinha 等 [28]采用此法制備了性質(zhì)優(yōu)良的殼聚糖 納米粒子 。 (2)緩控釋給藥 殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類(lèi)或酸酐類(lèi)藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，緩慢釋放，包封在殼聚糖 納米粒子 內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋?zhuān)蒯屘攸c(diǎn)。同時(shí)殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開(kāi)細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。癌癥的化學(xué)預(yù)防是利用天然的或合成的化合物干預(yù)癌前病變，預(yù)防腫瘤的發(fā)生或使腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤的目的。 mg。散射式納米粒度分析儀基于動(dòng)態(tài)光散射 （ DLS） 技術(shù)，與激光散射儀中動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量粒徑分布的原理一樣，是借助光子相關(guān)原理 （ PCS)檢測(cè)因布朗運(yùn)動(dòng)及多普勒效應(yīng)產(chǎn)生的散射光的微小頻移而得到散射質(zhì)點(diǎn)動(dòng)態(tài)行為的信息技術(shù)。 由于采用乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的影響因素有以下幾個(gè)：殼聚糖溶液濃度，油水比，表面活性劑用量， pH 值，攪拌速率，乳化時(shí)間，交聯(lián)劑用量，交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)溫度等。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到不同體積的油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h 處理后形成穩(wěn)定的W/O 型微乳液， 然后逐漸滴加 1%3 ml 的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL 不同濃度的 CS 溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 油相體系對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 23 和圖 是不同的油相體系對(duì)殼聚糖 納米粒子 粒徑的影響 .從圖中可以看出，甲苯作為油相制備所得的納米粒子粒徑與 PdI 明顯比液體石蠟制得的粒子大，這可能與油相體系的粘度有關(guān)。 sizes A 1A 2A 3A 4A 5 圖 不同油水比 納米粒子 的粒徑分布 Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。 shapes (A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 表面活性劑用量對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 25 與圖 是不同油水比對(duì)殼聚糖納米粒子粒徑的影響。 sizes No. Percentage Span80(g) Size() PdI B1 2% B2 3% B3 4% B4 5% B5 6% 2% 3% 4% 5%04080120160200240280320360 Size() 圖 不同 Span80 對(duì) 納米粒子 影響對(duì)比圖 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。 圖 不同 Span80 用量納米粒子的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。 sizes No. CS(mg/ml) size() PdI C1 10 C2 15 C3 20 C4 25 15 20 2504080120160200240280320 Size(m)m g/ m l 圖 殼聚糖濃度對(duì) 納米粒子粒徑的影響 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 25 圖 不同殼聚糖濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，交聯(lián)程度小，交聯(lián)效果差。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，一開(kāi)始局部進(jìn)行的是液滴內(nèi)交聯(lián)，隨后隨著交聯(lián)劑體積增加，進(jìn)行液滴間交聯(lián)，因此交聯(lián)得到的產(chǎn)物粒子分布不均勻，交聯(lián)效果差。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)， 最終確定制備載藥殼聚糖納米粒子的最佳條件為：殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1， 表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為 3%。 ①水相的配制 殼聚糖溶液的配置：稱(chēng)取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 375mg 溶于 25 ml 2% 醋酸溶液中配制成濃度為 15 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。通過(guò)各種表征方法分析各因素對(duì)殼聚糖 納米粒子 形成的粒徑與形貌的影響。 sizes (E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 28 (2)TEM 分析 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