【正文】 取樣品后用磷鎢酸進行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 16 表 23 油相體系比對 納米粒子 粒徑的影響 Table 23 Effect of different oil phase on nanoparticles39。（ CSNPs）。（ CSNPs）。本實驗將選取不同殼聚糖溶液濃度，不同油水比，不同的表面活性劑用量殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 14 以及不同的交聯(lián)劑用量，不同的油相體系，篩選出制備殼聚糖納米粒子的最佳工藝條件，用以后續(xù)的載藥制備。測試范圍下限可達到 1 nm，可測懸浮液、乳濁液、微乳液等體系。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗 40 分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中 （ 25 ℃ ） 進行。目前癌癥化學(xué)預(yù)防研究的主要目標就是尋找高效低毒，作用機制明確的化學(xué)預(yù)防藥物。 Mooren 等研究了潑尼松龍磷酸鈉殼聚糖 納米粒子 通過上皮細胞膜的情況，結(jié)果表明，殼聚糖 納米粒子可以改善上皮細胞膜對疏水性藥物通透性。 Wang 等制備了殼聚糖胰島素 納米粒子 ，其包封率高達 70%，胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性大于 95%，并且胰島素可以長時間穩(wěn)定釋放。常見的殼聚糖 納米粒子 制備方法還有離子凝膠法，反膠束法，殼聚糖包裹法和殼聚糖 納米粒子 乙?；ǖ?[33]。制備的方法是將用高壓空氣將殼聚糖溶液吹入堿性溶液如氫氧化鈉，氫氧化鈉甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成 納米粒子 ，如圖 所示。 圖 噴霧干燥法操作流程 (3)逐層自組裝 逐層自組裝法適用于制備球壁厚度可控的空心 納米粒子 。操作流程如圖 。其中，殼聚糖 納米粒子 載藥體系比其他體系更具優(yōu)勢。殼聚糖的化學(xué)名稱為 (14)2氨基 2 脫氧 D葡聚糖，甲殼素的化學(xué)名稱為 (14)2乙酰胺基 2 脫氧 D葡聚糖 [27]。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他親水性生物可降解聚合物 [23]。納米技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在一下幾個方面：控釋載藥微粒，靶向載藥微粒，磁導(dǎo)航靶向載藥微粒，基因載體 [20]。1990 年 7 月，在美國巴爾的摩召開了第一界國際納米科技會議，標志著納米科技的正式誕生。 Chen等 [15]通過實驗比較幾種含硒化合物對八種人類癌癥細胞的抗癌活性，實驗證明， SeC 與亞硒酸鹽對 A375， MCF7， HepG2， SW620 等癌細胞的細胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸鹽等強。而相比之下，有機硒化合物吸收率高，生物活性強，毒性低和環(huán)境污染小，不僅能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上也比無機硒顯著，抗癌作用更強 [11]。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金屬，抗逆境等多種生物學(xué)活性 [8] 。但由于毒性，硒曾被認為是一種對高級生物有害的元素。殼聚糖 (CS)是一種優(yōu)良的天然藥物載體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和無毒性 ,被廣泛地用作醫(yī)藥載體。本文以殼聚糖為載體，戊 二醛為交聯(lián)劑，液體石蠟為乳化體系，制備出粒徑小，分散性好，載藥率 及包封率較高的 SeC 殼聚糖 納米粒子 。 1957 年美國營養(yǎng)學(xué)家 Schwarz 和 Foltz 首次用硒治療動物肝壞死取得成功后，硒逐漸明確為動物體內(nèi)必需的微量元素 [2] 。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽過氧化酶（ GSHPx）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在， GSHPx 能減輕或阻斷自由基所致的脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，保護蛋白質(zhì)、清除自由基和 DNA 及生物膜的完整性，修復(fù)損傷分子部位；同時能提高機體免疫能力，抵抗疾病 [9]。其中含硒氨基酸 硒代半胱氨酸（ selenocysteine）是生物合成和摻入到蛋白質(zhì)分子中的第 21 種氨基酸[12]。且 SeC 對人類正常纖維原細胞 Hs68 的細胞毒性很小， IC50400 μΜ，毒性遠小于亞硒酸鹽。納米，是尺寸度量單位， 1 納米 =109 米，相當(dāng)于 4 個原子并列的直徑。其中，納米藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中控釋緩釋的應(yīng)用極為廣泛，提高藥物的利用率療效和減少藥物的副作用已成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的一項重要課題。但是，通過化學(xué)方法合成得到的大部分藥物載體在生物相容性，可降解性以及細胞毒性等方面還存在不盡如意的地方 [24]。結(jié)構(gòu)式如圖 所示。它能保護包埋物免受外界環(huán)境影響，以及屏蔽味道，顏色或氣味，降低揮發(fā)性和毒性，控制可持續(xù)釋放，增加藥效等。沈宏亮等 [34]利用乳化交聯(lián)法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖 納米粒子 ，并對殼聚糖 納米粒子 的體外釋藥性能進行了深入的研究。 納米粒子 的球殼是通過溶質(zhì)逐層沉降制得的。然后用冷熱水交替洗滌提純產(chǎn)物。 殼聚糖 納米粒子 的應(yīng)用 殼聚糖 納米粒子 在腫瘤治療方面應(yīng)用廣泛 [33] 。 Chandy 等 [37]制備了殼聚糖包衣的 PLA/PLGA 納米粒子 ，用于 5氟尿嘧啶的腦膠質(zhì)瘤的靶向治療，研究發(fā)現(xiàn)所得 納米粒子 表面孔空隙率低，藥物初次突釋后呈典型的二相釋藥，可靶向結(jié)合腦膠質(zhì)瘤，且穩(wěn)定釋放 30 d 以上。 Mitra 等將 Doxorubicin（ DXR）包封于殼聚糖殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 11 納米粒子 中，不僅腫瘤實體內(nèi)藥物濃度提高，作用維持時間延長，治療效果改善，不良反應(yīng)也明顯減輕。硒代胱氨酸是一種新型高效的抗腫瘤藥物，生物活性高，對正常細胞毒性小。 實驗儀器 表 22 實驗儀器 Table 22 Apparatus used in experiment 儀器名稱 型號 產(chǎn)地 電子天平 BP301S 德國 Sartorius 公司 離心機 Centrifuge 5804R Eppendorf 超聲破碎儀 JY92IIDN 寧波新芝生物科技股份有限公司 納米粒度儀 NanoZS 英國馬爾文 (Malvern)公司 透射電子顯微鏡 TECNAI10 荷蘭 Philips 相關(guān)儀器原理 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 13 （ 1） NanoZS 型納米粒度儀 英國馬爾文公司 (Malvern) NanoZS 型納米粒度儀，入射光為氦氖激光，波長 λ = 633 nm，入射角 90176。本論文中，利用納米粒度儀來快速、準確方便地對納米溶膠樣品中顆粒 的大小及分布、形態(tài)等進行測定。 (1)不同油相體系的 選擇 水相： 稱取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 500 mg，溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成 20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 (3)不同表面活性劑用量的選擇 水相：稱取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 500 mg，溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成 20 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 (5)不同交聯(lián)劑用量的選擇 水相：稱取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 375 mg 溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度為 15 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 sizes No. size() PdI paraffin toluene paraffin toluene 1 2 3 4 2 3 4 50100200300400500 t ol ue nepa ra ffi nV / m lSize() 圖 油相體系對 納米粒子粒徑的影響 Fig. Comparison of different oil phase on nanoparticles’ size 油水比對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 24 與圖 是不同油水比對殼聚糖納米粒子粒徑的影響。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。在體系中加入乳化劑是殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 20 為了獲得穩(wěn)定的乳液。 sizes (B1) 2% (B2) 3% (B3) 4% (B4) 5% (B5) 6% (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。由表 24 與圖 28可見，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為 10 mg/ml 時，產(chǎn)物的粒徑達到了微米級。 sizes (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL (C4) 25 mg/mL (2) TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。這可能是由于選擇的交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)適中，在體積較小時已經(jīng)能夠與殼聚糖交聯(lián)固化，當(dāng)體積增加時，多余的交聯(lián)劑不參加交聯(lián)。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。 mg。 實驗儀器 表 32 實驗儀器 Table 32 Apparatus used in experiment 儀器名稱 型號 產(chǎn)地 電子天平 BP301S 德國 Sartorius 公司 離心機 Centrifuge 5804R Eppendorf 超聲破碎儀 JY92IIDN 寧波新芝生物科技股份有限公司 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 Optima20xxDV 美國 PerkinElmer 公司 納米粒度儀 NanoZS 英國馬爾文 (Malvern)公司 透射電子顯微鏡 TECNAI10 荷蘭 Philips 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 30 實驗方法 由第二章空白殼聚糖納米粒子的制備條件優(yōu)化得出制備殼聚糖粒子的最佳條件，即殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1，表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為3%。 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM image of nanoparticles39。 sizes No. Glutaraldehyde aq Size() PdI E1 % E2 1% E3 3% E4 5% E5 7% 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 27 % 1% 3% 5% 7%04080120160200240280320 Size()V / m l 圖 不同交聯(lián)劑濃度對 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 ①同交聯(lián)劑體積 表 27 交聯(lián)劑 (1 %)體積對 納米粒子 粒徑的影響 Table 27Effect of G dosage on nanoparticles39。從 TEM 圖中可觀察到，殼聚糖溶液濃度過小或過大，得到的產(chǎn)物粒徑均比較大。當(dāng)殼聚糖濃度為 15 mg/mL 時，產(chǎn)物的粒徑最小，分布性最好。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)表面活性劑用量較少或較多時，形成的 納米粒子 性狀不規(guī)則，并且粒徑較大。乳化劑的用量需要適中，太少 (2%)可能導(dǎo)致界面層太薄，膜強度不夠。隨著油水比的增加，粒子逐漸變小，形貌趨于規(guī)則的圓球。這可能是由于在油相體積較小時，水相 納米粒子 分散不均勻，存在 納米粒子 粘連現(xiàn)象，而交聯(lián)劑的加入使得這些 納米粒子 粘連現(xiàn)象加重，從 PdI和粒徑分布圖看出，油相體積比小時 PdI 較大，分散不均勻。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后分別逐漸滴加 2 mL， 3 mL， 4 mL， 5 mL， 6 mL 1 %的戊二醛作為交聯(lián)劑進行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到含不同量 Span80 的油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 的戊二醛作為交聯(lián)劑進行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像。 ) ℃ ； 常用的納米粒度儀均采用激光作光源，故納米粒度儀也稱激光納米粒度儀或激光粒度儀。因此，希望借