【正文】 實驗材料 .................................................................................................................. 29 實驗儀器 .................................................................................................................. 29 實驗方法 .................................................................................................................. 30 實驗結果與討論 ................................................................................................................. 30 粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 ...................................................................................... 30 TEM 分析 ................................................................................................................. 32 包封率與載藥率的計算 ............................................................................................. 32 本章小結 ............................................................................................................................ 33 第四章 細胞毒性的研究 ................................................................................................................. 34 實驗部分 ............................................................................................................................ 34 實驗試劑 .................................................................................................................. 34 實驗儀器 .................................................................................................................. 34 實驗原理 .................................................................................................................. 35 實驗步驟 .................................................................................................................. 35 結果與討論 ........................................................................................................................ 36 粒徑分布 ......................................................................................................................... 36 TEM 分析與 EDX 分析 ............................................................................................. 36 載藥率與包封率 ....................................................................................................... 37 細胞存活率 .............................................................................................................. 37 本章小結 ............................................................................................................................ 38 第五章 總結與展望 ........................................................................................................................ 39 總結 ................................................................................................................................... 39 展望 ................................................................................................................................... 39 致 謝 ............................................................................................................................................. 40 參考文獻 ....................................................................................................................................... 41 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 1 第一章 緒論 硒 化學 的研究進展 硒是機體生命活動不可缺少的一種微量元素，被稱 為 ―生命奇效元素 ‖[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，硒與人類 40 種疾病有關，如大骨節(jié)病、克山病、白內(nèi)障、癌癥等。硒在生物體內(nèi)主要以有機硒化合物的形式存在，一類是含硒 氨基酸，另一類是含硒蛋白質(zhì)。結構式如圖 。 因此，希望借助納米藥物載體來提高細胞吸收，減少它進入腫瘤細胞的時間。納米技術與材料已經(jīng)在航天，汽車，消費日用品，生物醫(yī)學領域獲得應用，并取得一些列舉世矚目的成果 [19]。 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 4 圖 納米藥物載體的類型 目前，用于納米藥物載體研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物和天然高分子聚合物。 殼聚糖 納米粒子 在納米藥物載體領域的制備和應用 殼聚糖的結構與性質(zhì) 殼聚糖也稱為甲殼胺或幾丁聚糖殼聚糖，是一種天然的生物高分子線性多氨基多糖，為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物。曹等 [30]通過研究表明，殼聚糖無細胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以滿足醫(yī)藥衛(wèi)生及化妝品原料的基本要求。其反應機理如圖 。 納米粒子 的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯(lián)程度等因素 [32]。先將殼聚糖與 α氨基NCA（ Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量 L亮氨酸 NCA 分散至乙酸乙酯中，并用 Span80 乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應 2 h，經(jīng)進一步處理可得殼聚糖空心納米粒子 [32]。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成 W/O 型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖 納米粒子 。 Jaganathan 等 [37]采用乳化交聯(lián)法制備了載有破傷風類毒素的殼聚糖 納米粒子 ，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質(zhì)的活性， 納米粒子 的包封率也從加入海藻糖前的 40%提高到 90%。 (5)提高疏水性藥物對細胞膜的通透性，增 強細胞吸收 殼聚糖 納米粒子 溶脹引起的擴散釋藥過程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對藥物的吸收具有協(xié)同促進作用。 課題的研究意義與創(chuàng)新點 課題的研究意義 惡性腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病。 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 12 第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 實驗部分 材料與試劑 表 21 實驗試劑 Table 21 Reagents used in experiment 試劑名稱 規(guī)格 產(chǎn)地 液體石蠟 AR 天津市化學試劑公司 Span80 CP 天津市化學試劑公司 殼聚糖 90 % MW=60000 上海伯奧生物科技有限公司 戊二醛 (25%) AR 天津市百世化工有限公司 甲苯 AR 天津市百世化工有限公司 無水乙醇 AR 天津市百世化工有限公司 石油醚 AR 天津市百世化工有限公司 冰醋酸 AR 天津市百世化工有限公司 實驗用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國 Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為 177。但是很多研究證明對于粒徑小于 1 μm的顆粒，必須用 Mie 散射理論求解粒徑分布。取 500 μL CS 溶液緩慢滴加到含有表面活性劑 span80 的的液體石蠟中，經(jīng)超聲處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后滴加一定量的戊二醛作為交聯(lián)劑進行化學交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h，離心，然后 用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液 （ CSNPs）。 油相：分別量取液體石蠟 5 mL， 10 mL， 15 mL， 20 mL， 25 mL， 加 入占其體積 5%的 Span80,攪拌均勻后備用。 油相：量取液體石蠟 25 mL，加入占其體積 3%( g)的 Span80,攪拌均勻后備用。（ CSNPs）。 sizes No. O/W(V/V) Paraffin(ml) Size() PdI A1 10:1 5 A2 20:1 10 A3 30:1 15 A4 40:1 20 A5 50:1 25 10:1 20:1 30:1 40:1 50:10306090120150180 Size(m)O / W 圖 油水比對 納米粒子的 影響 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 18 Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。 圖 不同油相比 納米粒子 的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。 表 25 Span80 用量對 納米粒子 的影響 Table 25Effect of Span80 dosage on nanoparticles39。 綜上， span80 用量為油相體積的 3%時，殼聚糖納米粒子的粒徑最小，形貌較好，且分布均勻。 殼聚糖負載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 23 表 26 殼聚糖濃度對納米粒子粒徑的影響 Table 26Effect of CS concentration on nanoparticles39。因此，通過 TEM 圖表明，當殼聚糖溶液濃度為15 mg/mL時，制備得到的殼聚糖納米粒子粒徑小，形貌好，且分布均勻。戊二醛結構中存在著兩個活潑的醛基，有很高的反應活性，易與殼聚糖分子中的自由氨基反應，形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結構。結果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。由粒徑分布圖看出，殼聚糖 納米粒子 粒徑與油水相比成反比，與表面活性劑用量成正比，與殼聚糖濃度與成正比，與交聯(lián)劑濃度成正比，與油相體系的粘度成反比。 硒代胱氨酸溶液的配制：取