【正文】 相 納米粒子 分散不均勻，存在 納米粒子 粘連現(xiàn)象，而交聯(lián)劑的加入使得這些 納米粒子 粘連現(xiàn)象加重，從 PdI和粒徑分布圖看出，油相體積比小時(shí) PdI 較大，分散不均勻。隨著油水比的增加，粒子逐漸變小，形貌趨于規(guī)則的圓球。乳化劑的用量需要適中，太少 (2%)可能導(dǎo)致界面層太薄，膜強(qiáng)度不夠。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)表面活性劑用量較少或較多時(shí)，形成的 納米粒子 性狀不規(guī)則，并且粒徑較大。當(dāng)殼聚糖濃度為 15 mg/mL 時(shí)，產(chǎn)物的粒徑最小，分布性最好。從 TEM 圖中可觀察到，殼聚糖溶液濃度過(guò)小或過(guò)大，得到的產(chǎn)物粒徑均比較大。 ①同交聯(lián)劑體積 表 27 交聯(lián)劑 (1 %)體積對(duì) 納米粒子 粒徑的影響 Table 27Effect of G dosage on nanoparticles39。 sizes No. Glutaraldehyde aq Size() PdI E1 % E2 1% E3 3% E4 5% E5 7% 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 27 % 1% 3% 5% 7%04080120160200240280320 Size()V / m l 圖 不同交聯(lián)劑濃度對(duì) 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM image of nanoparticles39。 實(shí)驗(yàn)儀器 表 32 實(shí)驗(yàn)儀器 Table 32 Apparatus used in experiment 儀器名稱 型號(hào) 產(chǎn)地 電子天平 BP301S 德國(guó) Sartorius 公司 離心機(jī) Centrifuge 5804R Eppendorf 超聲破碎儀 JY92IIDN 寧波新芝生物科技股份有限公司 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 Optima20xxDV 美國(guó) PerkinElmer 公司 納米粒度儀 NanoZS 英國(guó)馬爾文 (Malvern)公司 透射電子顯微鏡 TECNAI10 荷蘭 Philips 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 30 實(shí)驗(yàn)方法 由第二章空白殼聚糖納米粒子的制備條件優(yōu)化得出制備殼聚糖粒子的最佳條件，即殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1，表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為3。通過(guò)各種表征方法分析各因素對(duì)殼聚糖 納米粒子 形成的粒徑與形貌的影響。 sizes (E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 28 (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。 sizes ②不同交聯(lián)劑濃度 表 28 與圖 表明，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的濃度有關(guān)。殼聚糖濃度較大， 納米粒子 間粘連現(xiàn)象嚴(yán)重，造成產(chǎn)物粒徑大。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時(shí)分子較大，最終造成交聯(lián)得到的粒子 粒徑也變大。當(dāng)乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯(lián)固化后形成的納米粒子 粒徑較小，且分布均勻， TEM 成像時(shí)襯度足夠，故磷鎢酸染 色后，仍呈黑色圓球。結(jié)果表明，控制 span80 的用量為油相體積的 3%可以取得粒徑較小的產(chǎn)物。隨著油相體積增加，油包水乳液的油膜增厚，形成的乳滴較穩(wěn)定，且分散均勻，交聯(lián)固化后的產(chǎn)物呈圓球狀。 表 24 油水比對(duì)納米粒子 粒徑的影響 Table 24Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles 39。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后分別逐漸滴加 %， 1%， 3%， 5%， 7%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無(wú)水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 15 (4)不同殼聚糖濃度的選擇 水相：分別稱取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg 溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成濃度分別為 10 mg/mL， 15 mg/mL， 20 mg/mL， 25 mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 (2)不同油水比的選擇 水相：稱取分子量為 60000 的殼聚糖（ 90%）的殼聚糖 500 mg，溶于 25 mL 2% 醋酸溶液中配制成 20 mg/ml的殼聚糖溶液，攪拌至完全溶解備用。 實(shí)驗(yàn)方法 稱取 CS 溶于 2%乙酸溶液中，攪拌使其溶解后備用。其依據(jù)的光學(xué)原理為 Fraunhofer 衍射和 Mie 散射理論，因此相應(yīng)的激光粒度分析儀分為激光衍射式和激光動(dòng)態(tài)散射式兩類。 創(chuàng)新點(diǎn) 通過(guò)以 CSNPs 為載體，有效增強(qiáng) SeC 的體外抗腫瘤活性，并顯著縮短 SeC 對(duì) MCF7起作用的時(shí)間。 Alexakis 等制備了小牛胸腺 DNA海藻酸酯 納米粒子 ，外面包覆殼聚糖制成載藥 納米粒子 后經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)藥物不被破壞， 60%DNA可以從糞便等排泄物中得到。徐海濤等觀察了殼聚糖 順鉑緩釋 納米粒子 對(duì) C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤內(nèi)化療的療效，結(jié)果表明，殼聚糖 順鉑 納米粒子 毒性小，安全性較高，療效可靠。經(jīng)沙鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性增加，能夠黏附在胃黏膜上。溶劑蒸發(fā)法又稱液中干燥法，常用的溶劑蒸發(fā)法是根據(jù)聚合物與藥物的性質(zhì)制成乳液體系，形成穩(wěn)定乳液后，采用升溫，減壓抽提或連續(xù)攪拌等方法使有機(jī)溶劑擴(kuò)散進(jìn)入連續(xù)相并通過(guò)連續(xù)相和空氣的界面蒸發(fā)， 納米粒子 固化，并經(jīng)過(guò)處理最終得到載藥 納米粒子 的過(guò)程 [32]。 Wang 等在溫和的條件下通過(guò)界面聚合法一步制備多糖 多肽復(fù)合空心 納米粒子 。此法是將殼聚糖溶于酸性溶液中，再將藥物溶解或分散于該殼聚糖溶液，加入一定量的交聯(lián)劑，在惰性的熱氣流中噴霧干燥，當(dāng)液體通過(guò)蠕動(dòng)泵輸送到噴嘴后，壓縮空氣將液體霧化為小液滴，液滴與熱空氣被共同吹入一個(gè)腔體中，液滴中的酸迅速蒸發(fā)，從而形成殼聚糖含藥納米粒子 [33]。它是利用殼聚糖的活性氨基基團(tuán)與醛類的醛基交聯(lián)，得到一種 Schiff 堿。殼聚糖不與體內(nèi)組織產(chǎn)生異物反應(yīng)，在體內(nèi)被溶菌酶降解為對(duì)人體無(wú)毒的 N乙 酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖 [29]。由于生物大分子可以從自然界的動(dòng)植物中獲得，生物相容性良好，并且可被生物體內(nèi)的酶降解，毒副作用較小，且分子上帶有的羥基，氨基，羧基等大量可反應(yīng)的官能團(tuán)，可作為化學(xué)修飾的位點(diǎn)，因此它們作為藥物載體材料具有廣闊的應(yīng)用前景 [25]。因此，尋找生物相容性好，低毒性的納米藥 物載體成為了近年來(lái)研究的目標(biāo)。進(jìn)入 21 世紀(jì)，納米技術(shù)迅速發(fā)展，作為一個(gè)多學(xué)科交叉領(lǐng)域，涉及面廣應(yīng)用十分廣泛。 μΜ，說(shuō)明 SeC 不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞， 對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。硒代胱氨酸 是胱氨酸分子中 S 被 Se 所取代后的含硒氨基酸 [14]。有機(jī)硒主要包括硒多糖，含硒蛋白質(zhì)，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有機(jī)硒化合物。 1988 年，我國(guó)已經(jīng)把硒列為膳食營(yíng)養(yǎng)素之一。 Selenocystine。殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性的研究 暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文 I 畢業(yè)論文 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性 的研究 摘 要 硒代胱氨酸 (SeC)是一種天然的含硒氨基酸，研究證明， SeC 作為一種新型高效的抗腫瘤藥物在腫瘤化學(xué)預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要的作用。 crosslinking emulsification。此后，硒與硒化合物的生理作用受到普遍關(guān)注。無(wú)機(jī)硒主要包括硒，硒酸鹽 (亞硒酸鈉 ,亞硒酸鋅等 )，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氫，硒化鈉，硒化鉀等）等。在哺乳動(dòng)物組中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸 (SeCys) 和硒代蛋氨酸 (SeMet)。 雖然 SeC 作為抗腫瘤藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是從 Chen 等 [16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SeC 的水溶性與穩(wěn)定性較差， 進(jìn)入 MCF7 細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)間比較長(zhǎng)， 36 h 之后才觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，且 72 h 后的 IC50=177。當(dāng)物體達(dá)到納米級(jí)后，納米粒子在熱學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)力學(xué)及電化學(xué)方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì) [18]。雖然，納米藥物載體作為載藥系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問(wèn)題，如生物相容性以及細(xì)胞毒性等。蛋白質(zhì)一般包括如明膠，白蛋白，絲蛋白等物質(zhì)，多糖類一般包括如殼聚糖，海藻酸 鈉，環(huán)糊精，果膠等物質(zhì)。它不溶于水和有機(jī)溶劑，但是能溶于 PH 的乙酸（ 13 %）溶液中 [28]。 (1)乳化交聯(lián)法 乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖 納米粒子 的常用方法之一。其操作流程如圖 。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 8 圖 逐層自組裝反應(yīng)流程 (4)界面聚合法 界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水 /油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。 圖 沉淀法反應(yīng)示意圖 (6)其他制備方法 制備殼聚糖 納米粒子 的方法還有很多。 Hejazi 等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖 納米粒子 。 (4)降低藥物的毒副作用，提高療效 載有藥物的殼聚糖 納米粒子 循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對(duì)機(jī)體正常組織的毒副作用，同時(shí)由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無(wú)毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。殼聚糖屬親水性聚合物，可制得不同大小的 納米粒子 ，將疫苗，蛋白質(zhì)，抗生素類藥物制成 納米粒子 系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長(zhǎng)效緩釋靶向的目的。本文通過(guò)乳化交聯(lián)法制得殼聚糖 納米粒子 載體負(fù)載硒代胱氨酸，并對(duì) MCF7 進(jìn)行 體外抗腫瘤活性 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能夠增強(qiáng)硒代胱氨酸對(duì) MCF7 的細(xì)胞毒性，并在較短的時(shí)間內(nèi)起作用。激光粒度分析法是根據(jù)激光照射到顆粒后，顆粒能使散射的激光產(chǎn)生衍射或散射的現(xiàn)象來(lái)測(cè)試粒度分布的。本論文研究中以 TEM 觀察殼聚糖納米材料的結(jié)構(gòu)。（ CSNPs）。（ CSNPs）。（ CSNPs）。隨著油水相體積比增大，水殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 17 相 納米粒子 能夠被較厚的油相膜隔離開(kāi)，降低了在超聲分散過(guò)程中 納米粒子 粘連的幾率，從 PdI和粒徑分布圖看出，油水相體積比增大，粒徑分布更加均勻，粒徑減小。這可能是由于油相體積較小，乳化時(shí)殼聚糖溶液無(wú)法形成規(guī)則乳滴，造成交聯(lián)固化后的產(chǎn)物不規(guī)則。隨著乳化劑用量的增加，界面膜厚度和強(qiáng)度逐漸增加，過(guò)量會(huì)導(dǎo)致膜層太厚，不容易交聯(lián)，后續(xù)的洗滌也變得困難。這可能是由于乳化劑過(guò)少或過(guò)多造成乳滴界面膜不穩(wěn)定，表面不均勻，存在凹陷，造成在 TEM 成像時(shí)的襯度太低，以致觀察不到物像，故需要磷鎢酸染色。隨著殼聚糖溶液濃度的增加，產(chǎn)物的粒徑也增加，分散性變差，且顏色加深，由白色逐漸變成棕黃色。殼聚糖濃度較小，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)松散。 sizes No. Glutaraldehyde aq(1%)/ml Size() PdI D1 2 D2 3 D3 4 D4 5 D5 6 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 26 2 3 4 5 604080120160200240280 Size(m)V / m l 圖 不同交聯(lián)劑體積對(duì) 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde volume on nanoparticles39。 sizes E 1E 2E 3E 4E 5 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 shapes of different glutaraldehyde concentration (E1) % (E3) 3% (E5) 7% 本章小結(jié) 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，表明乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子受到幾個(gè)因素的影響 ——不同油相體系，油水相比例，表面活性劑用量，殼聚糖濃度以及交聯(lián)劑