【正文】 ................................................................. 29 實(shí)驗(yàn)方法 .................................................................................................................. 30 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 ................................................................................................................. 30 粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 ...................................................................................... 30 TEM 分析 ................................................................................................................. 32 包封率與載藥率的計(jì)算 ............................................................................................. 32 本章小結(jié) ............................................................................................................................ 33 第四章 細(xì)胞毒性的研究 ................................................................................................................. 34 實(shí)驗(yàn)部分 ............................................................................................................................ 34 實(shí)驗(yàn)試劑 .................................................................................................................. 34 實(shí)驗(yàn)儀器 .................................................................................................................. 34 實(shí)驗(yàn)原理 .................................................................................................................. 35 實(shí)驗(yàn)步驟 .................................................................................................................. 35 結(jié)果與討論 ........................................................................................................................ 36 粒徑分布 ......................................................................................................................... 36 TEM 分析與 EDX 分析 ............................................................................................. 36 載藥率與包封率 ....................................................................................................... 37 細(xì)胞存活率 .............................................................................................................. 37 本章小結(jié) ............................................................................................................................ 38 第五章 總結(jié)與展望 ........................................................................................................................ 39 總結(jié) ................................................................................................................................... 39 展望 ................................................................................................................................... 39 致 謝 ............................................................................................................................................. 40 參考文獻(xiàn) ....................................................................................................................................... 41 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 1 第一章 緒論 硒 化學(xué) 的研究進(jìn)展 硒是機(jī)體生命活動(dòng)不可缺少的一種微量元素，被稱 為 ―生命奇效元素 ‖[1]。然而， SeC 進(jìn)入腫瘤細(xì)胞與其作用需要較長(zhǎng)一段時(shí)間，細(xì)胞滲透性較差。 關(guān)鍵詞 ：殼聚糖 納米粒子 ；乳化交聯(lián)法；硒代胱氨酸； 體外抗腫瘤活性 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性的研究 暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文 II Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystineloaded chitosan nanoparticles Abstract Selenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid, has been shown to be a novel pound with broadspectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improve drug stability as well as anticancer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biopatible, biodegradable and nontoxic properties. In this paper, Chitosan loaded SeC nanoparticles were prepared in emulsion by using glutaraldehyde as crossing agent, span80 as emulsifier and paraffin as oil phase. Lastly, it’s proved that chitosan nanoparticles loaded SeC had greater toxicity and antitumor activity to MCF7. Key words: Chitosan nanoparticles。 1975 年Awasthi 等人首次明確指出，硒是人體必需的微量元素 [4]。根據(jù)硒在自然界的存在形態(tài)，硒化合物可分為無機(jī)硒和有機(jī)硒化合物 [10]。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 2 硒代胱氨酸的研究現(xiàn)狀 硒代胱氨酸的性質(zhì) 硒代氨基酸在有機(jī)硒化合物中，有特殊的重要性。因此， SeC 是一種新型高效的抗腫瘤藥物。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸 效應(yīng)，表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)四大效應(yīng)。一種理想的納米藥物載體應(yīng)具備以下特征 [21] ： ①具有較高的載藥量 ②具有較高的包封率 ③制備和純化方法簡(jiǎn)便，容易放大到工業(yè)化生產(chǎn) ④載體材料可生物降解，毒性較低或沒有毒性 ⑤具有適當(dāng)?shù)牧脚c粒型 ⑥具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間 納米藥物載體的種類有以下幾種（如圖 所示）：①納米聚合物藥物載體 ，包括：聚合物納米粒（納米囊和納米球）納米樹突狀聚合物和聚合物膠束②納米脂質(zhì)體藥物載體，③納米病毒藥物載體，④碳納米管 [22]。用于納米藥物載體的生物大分子主要包含蛋白質(zhì)和多糖兩大類。由于氨基的存在，它是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 6 制備殼聚糖 納米粒子 的方法有多種 [32]，其選擇的依據(jù)受以下因素影響： ① 目標(biāo)粒徑分布； ② 有效成分的熱化學(xué)性質(zhì)與 穩(wěn)定性； ③ 有效成分的釋藥動(dòng)力學(xué)與重現(xiàn)性； ④ 載藥納米粒子 的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。 (2)噴霧干燥法 噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。 Shao 等 [36]等將聚苯乙烯磺酸鈉 /殼聚糖聚電解質(zhì)溶液吸附于制備好的殼聚糖 納米粒子 模板表面，經(jīng)過調(diào)節(jié) pH 值，層層沉積后，進(jìn)一步處理即可得到所需的殼聚糖 納米粒子 ，如圖 所示 [32]。此法制備的殼聚糖 納米粒子 酸穩(wěn)定性較強(qiáng) [31]。所包埋的常見藥物有：牛血清白蛋白（ BSA），青霉素，四環(huán)素，維生殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 10 素，胰島素等。李揚(yáng)等利用乳化分散法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖 納米粒子 ，體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明所載藥物可如預(yù)想設(shè)計(jì)到達(dá)結(jié)腸定位釋放。與化學(xué)合成藥物相比，肽類藥物具有毒副作用輕，吸收快的特點(diǎn)，但由于此類藥物分子質(zhì)量大，在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差，在胃腸道內(nèi)容易被酶降解，半衰期短，生物利用度極低，臨床應(yīng)用受限制。因此，希望借助納米藥物載體來提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。 ) ℃ ； 常用的納米粒度儀均采用激光作光源，故納米粒度儀也稱激光納米粒度儀或激光粒度儀。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到含不同量 Span80 的油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后分別逐漸滴加 2 mL， 3 mL， 4 mL， 5 mL， 6 mL 1 %的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。這可能是由于在油相體積較小時(shí)，水