【正文】 .................................................... 37 本章小結(jié) ............................................................................................................................ 38 第五章 總結(jié)與展望 ........................................................................................................................ 39 總結(jié) ................................................................................................................................... 39 展望 ................................................................................................................................... 39 致 謝 ............................................................................................................................................. 40 參考文獻(xiàn) ....................................................................................................................................... 41 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 1 第一章 緒論 硒 化學(xué) 的研究進(jìn)展 硒是機(jī)體生命活動(dòng)不可缺少的一種微量元素，被稱 為 ―生命奇效元素 ‖[1]。 1973 年， Rotruck 等人發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過氧化物酶 GSHPx 的活性成分后 [3]，已經(jīng)陸續(xù)有 25 種含硒蛋白被發(fā)現(xiàn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，硒與人類 40 種疾病有關(guān)，如大骨節(jié)病、克山病、白內(nèi)障、癌癥等。近年來，硒與硒化合物的抗腫瘤活性受到普遍關(guān)注，人們一直致力于設(shè)計(jì)和改造含硒化合物，以尋找抗腫瘤活性強(qiáng)，抗腫瘤譜廣，毒副作用低，適用于臨床的含硒抗腫瘤藥物 [1]。硒在生物體內(nèi)主要以有機(jī)硒化合物的形式存在，一類是含硒 氨基酸，另一類是含硒蛋白質(zhì)。從此有機(jī)硒化合物的研究引起了廣泛關(guān)注， Shahd 等人在 20xx 年報(bào)道了有機(jī)硒化合物 Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治療子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌 [13]。結(jié)構(gòu)式如圖 。因此， SeC 具有更廣譜高效的抗腫瘤活性，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。 因此，希望借助納米藥物載體來提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。所謂納米技術(shù)則是指 nm 內(nèi)的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)的構(gòu)造技術(shù)，即納米級(jí)材料的設(shè)計(jì)，制造，測量和控制技術(shù) [17]。納米技術(shù)與材料已經(jīng)在航天，汽車，消費(fèi)日用品，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得應(yīng)用，并取得一些列舉世矚目的成果 [19]。 納米藥物載體的研究進(jìn)展 理想的納米粒載體應(yīng)是無毒和可生物 的。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 4 圖 納米藥物載體的類型 目前，用于納米藥物載體研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物和天然高分子聚合物。近年來，生物大分子材料由于其可再生性，無毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等優(yōu)點(diǎn)成為藥物載體研究的熱點(diǎn)，于是利用生物大分子材料來制備納米藥物載體的研究應(yīng)運(yùn)而生。 殼聚糖 納米粒子 在納米藥物載體領(lǐng)域的制備和應(yīng)用 殼聚糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 殼聚糖也稱為甲殼胺或幾丁聚糖殼聚糖，是一種天然的生物高分子線性多氨基多糖，為甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物。 圖 殼聚糖與甲殼素的結(jié)構(gòu) (A) 甲殼素 (B)殼聚糖 殼聚糖的每個(gè) C6 單元均含有一個(gè)氨基，兩個(gè)自由羥基。曹等 [30]通過研究表明，殼聚糖無細(xì)胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以滿足醫(yī)藥衛(wèi)生及化妝品原料的基本要求。近幾年殼聚糖 納米粒子 的 制備和應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn) [31]。其反應(yīng)機(jī)理如圖 。 圖 殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)方程式 C h i t os a n a qu e ou s s ol u t i onO il ph a s eE m u ls if ic a ti on ( W /O) e m u ls io nHa r de n in g of dr ople tsS e pa r a ti on of pa r ti c le sS ti r or U lt r a s ou n dC r os s li n kin ga g e n t 圖 乳化交聯(lián)法操作流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 7 采用乳化交聯(lián)法，可以通過控制含水液滴的大小來控制 納米粒子 的粒徑，最終產(chǎn)物納米粒子 的粒徑也取決于在形成乳液時(shí)的油相比，交聯(lián)程度等。 納米粒子 的粒徑取決于噴嘴的直徑，噴嘴流率，霧化壓力，入口溫度和交聯(lián)程度等因素 [32]。通過限制溶質(zhì)沉降次數(shù)可控制空心 納米粒子 的球殼厚度，除去 納米粒子 中的核物質(zhì)即可獲得所需的空心結(jié)構(gòu)。先將殼聚糖與 α氨基NCA（ Ncarboxyanhydride）接枝共聚，再將一定量 L亮氨酸 NCA 分散至乙酸乙酯中，并用 Span80 乳化后與水溶性殼聚糖在一定條件下反應(yīng) 2 h，經(jīng)進(jìn)一步處理可得殼聚糖空心納米粒子 [32]。另一種操作方法為：在殼聚糖溶液中加入表面活性劑，然后再逐滴加入硫酸鈉溶液，攪拌或超聲 30 分鐘后，離心分離出產(chǎn)物。目前最常用的方法是將殼聚糖醋酸溶液加入含表面活性劑的液體石蠟中，形成 W/O 型乳劑，升溫再減壓干燥除去溶劑，分離得到殼聚糖 納米粒子 。它的應(yīng)用主要有以下幾方面： (1)作為藥物載體，可包埋多種類型藥物 殼聚糖 納米粒子 由于其良好的生物相容性，生物降解性和低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于藥物載體方面。 Jaganathan 等 [37]采用乳化交聯(lián)法制備了載有破傷風(fēng)類毒素的殼聚糖 納米粒子 ，穩(wěn)定劑海藻糖能夠保持抗原蛋白質(zhì)的活性， 納米粒子 的包封率也從加入海藻糖前的 40%提高到 90%。 (3)增加藥物的靶向性 殼聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通過控制殼聚糖 納米粒子 的大小，形狀，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法，能夠提高殼聚糖 納米粒子 的靶向效果。 (5)提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性，增 強(qiáng)細(xì)胞吸收 殼聚糖 納米粒子 溶脹引起的擴(kuò)散釋藥過程可以增加藥物在吸收部位的濃度梯度，對(duì)藥物的吸收具有協(xié)同促進(jìn)作用。 (6)提高藥物的穩(wěn)定性 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因重組肽和蛋白質(zhì)藥物不斷涌現(xiàn)，應(yīng)用于臨床的種類也越來越多。 課題的研究意義與創(chuàng)新點(diǎn) 課題的研究意義 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病。 但是研究表明， SeC 不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 12 第二章 空白殼聚糖納米粒子的制備 實(shí)驗(yàn)部分 材料與試劑 表 21 實(shí)驗(yàn)試劑 Table 21 Reagents used in experiment 試劑名稱 規(guī)格 產(chǎn)地 液體石蠟 AR 天津市化學(xué)試劑公司 Span80 CP 天津市化學(xué)試劑公司 殼聚糖 90 % MW=60000 上海伯奧生物科技有限公司 戊二醛 (25%) AR 天津市百世化工有限公司 甲苯 AR 天津市百世化工有限公司 無水乙醇 AR 天津市百世化工有限公司 石油醚 AR 天津市百世化工有限公司 冰醋酸 AR 天津市百世化工有限公司 實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國 Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為 177。測量溫度 ( 177。但是很多研究證明對(duì)于粒徑小于 1 μm的顆粒，必須用 Mie 散射理論求解粒徑分布。 (2) 透射電子顯微鏡 透射電子顯微鏡（ Transmission electron microscope， TEM），型號(hào) TEANAI10 型透射電子顯微鏡 philips，或高分辨透射電子顯微鏡 （ High resolution transmission electron microscope， HRTEM)，它是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。取 500 μL CS 溶液緩慢滴加到含有表面活性劑 span80 的的液體石蠟中，經(jīng)超聲處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后滴加一定量的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h，離心，然后 用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液 （ CSNPs）。 油相：分別 選用液體石蠟 ，甲苯各 25 mL，加入占其體積 5%( g)的 Span80,攪拌均勻后備用。 油相：分別量取液體石蠟 5 mL， 10 mL， 15 mL， 20 mL， 25 mL， 加 入占其體積 5%的 Span80,攪拌均勻后備用。 油相：量取液體石蠟 25 mL，加入占其體積 2%， 3%， 4%， 5%， 6%的 Span80， 攪拌均勻后備用。 油相：量取液體石蠟 25 mL，加入占其體積 3%( g)的 Span80,攪拌均勻后備用。 油相：量取液體石蠟 25 mL，加入占其體積 3% ( g)的 Span80,攪拌均勻后備用。（ CSNPs）。從表跟圖中可以看出，粒子粒徑在油相體積較小時(shí)粒徑隨油相體積增加而增加，當(dāng)油相體積增加到一定量時(shí)，則隨著油相體積的增加而減少。 sizes No. O/W(V/V) Paraffin(ml) Size() PdI A1 10:1 5 A2 20:1 10 A3 30:1 15 A4 40:1 20 A5 50:1 25 10:1 20:1 30:1 40:1 50:10306090120150180 Size(m)O / W 圖 油水比對(duì) 納米粒子的 影響 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 18 Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)油水比較小時(shí)，得到的粒徑較小，但是形貌不規(guī)則。 圖 不同油相比 納米粒子 的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。乳化劑的加入，可以在油水界面上形成一層界面膜，降低乳滴的表面能，減少 納米粒子 粘連的幾率。 表 25 Span80 用量對(duì) 納米粒子 的影響 Table 25Effect of Span80 dosage on nanoparticles39。結(jié)果與納米粒度儀測殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 22 得的平均粒徑大約相符。 綜上， span80 用量為油相體積的 3%時(shí)，殼聚糖納米粒子的粒徑最小，形貌較好，且分布均勻。這可能是由于殼聚糖溶液濃度過低，水相液滴中所含的殼聚糖量極少，乳化分散后與交聯(lián)劑交聯(lián)得到的粒子結(jié)構(gòu)松散，不致密，因此粒徑較大。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 23 表 26 殼聚糖濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響 Table 26Effect of CS concentration on nanoparticles39。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。因此，通過 TEM 圖表明，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為15 mg/mL時(shí)，制備得到的殼聚糖納米粒子粒徑小，形貌好，且分布均勻。也可能是由于隨著交聯(lián)劑體積的增加，交聯(lián)得到的殼聚糖 納米粒子 結(jié)構(gòu)松散，粒徑分布不均勻，在洗滌過程中，大的粒子聚集沉淀被洗去，剩下粒徑比較小的殼聚糖納米粒子，因此殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的體積無關(guān)。戊二醛結(jié)構(gòu)中存在著兩個(gè)活潑的醛基，有很高的反應(yīng)活性，易與殼聚糖分子中的自由氨基反應(yīng)，形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 表 28 交聯(lián)劑濃度對(duì)納米粒子粒徑的影響 Table 28Effect of G’s concentration on nanoparticles39。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。綜上，選擇 3 %的戊二醛溶液交聯(lián)時(shí)得到的產(chǎn)物粒徑較小，形貌好，且分布均勻。由粒徑分布圖看出，殼聚糖 納米粒子 粒徑與油水相比成反比，與表面活性劑用量成正比，與殼聚糖濃度與成正比，與交聯(lián)劑濃度成正比，與油相體系的粘度成反比。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗 40 分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中 （ 25 ℃ ） 進(jìn)行。 硒代胱氨酸溶液的配制：取