【正文】 les39。當(dāng)殼聚糖濃度為 15 mg/mL 時(shí)，產(chǎn)物的粒徑最小，分布性最好。 圖 不同 Span80 用量納米粒子的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)表面活性劑用量較少或較多時(shí)，形成的 納米粒子 性狀不規(guī)則，并且粒徑較大。 sizes No. Percentage Span80(g) Size() PdI B1 2% B2 3% B3 4% B4 5% B5 6% 2% 3% 4% 5%04080120160200240280320360 Size() 圖 不同 Span80 對(duì) 納米粒子 影響對(duì)比圖 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。乳化劑的用量需要適中，太少 (2%)可能導(dǎo)致界面層太薄，膜強(qiáng)度不夠。 shapes (A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 表面活性劑用量對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 25 與圖 是不同油水比對(duì)殼聚糖納米粒子粒徑的影響。隨著油水比的增加，粒子逐漸變小，形貌趨于規(guī)則的圓球。 sizes A 1A 2A 3A 4A 5 圖 不同油水比 納米粒子 的粒徑分布 Fig. Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles39。這可能是由于在油相體積較小時(shí)，水相 納米粒子 分散不均勻，存在 納米粒子 粘連現(xiàn)象，而交聯(lián)劑的加入使得這些 納米粒子 粘連現(xiàn)象加重，從 PdI和粒徑分布圖看出，油相體積比小時(shí) PdI 較大，分散不均勻。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 油相體系對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 23 和圖 是不同的油相體系對(duì)殼聚糖 納米粒子 粒徑的影響 .從圖中可以看出，甲苯作為油相制備所得的納米粒子粒徑與 PdI 明顯比液體石蠟制得的粒子大，這可能與油相體系的粘度有關(guān)。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后分別逐漸滴加 2 mL， 3 mL， 4 mL， 5 mL， 6 mL 1 %的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL 不同濃度的 CS 溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到含不同量 Span80 的油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到不同體積的油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h 處理后形成穩(wěn)定的W/O 型微乳液， 然后逐漸滴加 1%3 ml 的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 取 500 μL CS溶液緩慢滴加到油相溶液中，經(jīng)超聲 2 h處理后形成穩(wěn)定的 W/O 型微乳液，然后逐漸滴加 1%的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，超聲分散后在室溫下攪拌 3 h， 8000 r/min 離心，然后用無水乙醇和石油醚洗滌并離心，最后用蒸餾水清洗，得到乳白色溶液。 由于采用乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子的影響因素有以下幾個(gè)：殼聚糖溶液濃度，油水比，表面活性劑用量， pH 值，攪拌速率，乳化時(shí)間，交聯(lián)劑用量，交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)溫度等。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像。散射式納米粒度分析儀基于動(dòng)態(tài)光散射 （ DLS） 技術(shù)，與激光散射儀中動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量粒徑分布的原理一樣，是借助光子相關(guān)原理 （ PCS)檢測(cè)因布朗運(yùn)動(dòng)及多普勒效應(yīng)產(chǎn)生的散射光的微小頻移而得到散射質(zhì)點(diǎn)動(dòng)態(tài)行為的信息技術(shù)。 ) ℃ ； 常用的納米粒度儀均采用激光作光源，故納米粒度儀也稱激光納米粒度儀或激光粒度儀。 mg。因此，希望借助納米藥物載體來提高細(xì)胞吸收，減少它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的時(shí)間。癌癥的化學(xué)預(yù)防是利用天然的或合成的化合物干預(yù)癌前病變，預(yù)防腫瘤的發(fā)生或使腫瘤細(xì)胞分化逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤的目的。與化學(xué)合成藥物相比，肽類藥物具有毒副作用輕，吸收快的特點(diǎn)，但由于此類藥物分子質(zhì)量大，在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差，在胃腸道內(nèi)容易被酶降解，半衰期短，生物利用度極低，臨床應(yīng)用受限制。同時(shí)殼聚糖分子可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，打開細(xì)胞通道，有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力，促進(jìn)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。李揚(yáng)等利用乳化分散法制備了左氧氟沙星羧甲基殼聚糖 納米粒子 ，體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明所載藥物可如預(yù)想設(shè)計(jì)到達(dá)結(jié)腸定位釋放。 (2)緩控釋給藥 殼聚糖分子內(nèi)具有活性基團(tuán)氨基，可與含雙官能團(tuán)的醛類或酸酐類藥物發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，使藥物大量分布于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，緩慢釋放，包封在殼聚糖 納米粒子 內(nèi)的藥物具有明顯的緩釋，控釋特點(diǎn)。所包埋的常見藥物有：牛血清白蛋白（ BSA），青霉素，四環(huán)素，維生殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 10 素，胰島素等。 Sinha 等 [28]采用此法制備了性質(zhì)優(yōu)良的殼聚糖 納米粒子 。此法制備的殼聚糖 納米粒子 酸穩(wěn)定性較強(qiáng) [31]。 圖 界面聚合法反應(yīng)流程 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 9 (5)沉淀法 沉淀法是利用殼聚糖不溶于堿性溶液的性質(zhì)制備 納米粒子 。 Shao 等 [36]等將聚苯乙烯磺酸鈉 /殼聚糖聚電解質(zhì)溶液吸附于制備好的殼聚糖 納米粒子 模板表面，經(jīng)過調(diào)節(jié) pH 值，層層沉積后，進(jìn)一步處理即可得到所需的殼聚糖 納米粒子 ，如圖 所示 [32]。 He 等 [35]將配置好的殼聚糖水溶液與一定比例的戊二醛水溶液混合均勻，然后進(jìn)行噴霧干燥，制備出的殼聚糖 納米粒子 粒徑在 312 μm之間。 (2)噴霧干燥法 噴霧干燥法是以熱氣流干燥霧化液滴為基礎(chǔ)的。此法是將殼聚糖溶液加入含有表面活性劑的油相中形成 W/O 型乳劑，再加入一定量的交聯(lián)劑如戊二醛，甲醛，三聚磷酸鹽，檸檬酸鹽，硫酸鹽和京尼平等進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)固化，通過離心純化即可制得殼聚糖 納米粒子 [33]。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 6 制備殼聚糖 納米粒子 的方法有多種 [32]，其選擇的依據(jù)受以下因素影響： ① 目標(biāo)粒徑分布； ② 有效成分的熱化學(xué)性質(zhì)與 穩(wěn)定性； ③ 有效成分的釋藥動(dòng)力學(xué)與重現(xiàn)性； ④ 載藥納米粒子 的穩(wěn)定性與毒性溶劑殘留。 殼聚糖 納米粒子 的制備 殼聚糖緩釋體系主要分為：殼聚糖納米粒子，殼聚糖 微球 ，殼聚糖緩釋片，殼聚糖緩釋膜，殼聚糖緩釋凝膠 5 種類型 [26]。由于氨基的存在，它是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖。在自然界中，殼聚糖廣泛存在于低等植物菌類，藻類的細(xì)胞，節(jié)肢動(dòng)物蝦，蟹，蠅蛆和昆蟲的外殼，貝類，軟體動(dòng)物（如魷魚，烏賊）的外殼殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 5 和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，每年生物合成的資源量高大 100 億 t，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源 [26]。用于納米藥物載體的生物大分子主要包含蛋白質(zhì)和多糖兩大類。合成聚合物主要有聚乳酸（ PLA）、聚乙醇酸（ PGA）、聚乳酸共聚乙醇酸（ PLGA）、聚已內(nèi)酯（ PCL）、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐等。一種理想的納米藥物載體應(yīng)具備以下特征 [21] ： ①具有較高的載藥量 ②具有較高的包封率 ③制備和純化方法簡(jiǎn)便，容易放大到工業(yè)化生產(chǎn) ④載體材料可生 物降解，毒性較低或沒有毒性 ⑤具有適當(dāng)?shù)牧脚c粒型 ⑥具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間 納米藥物載體的種類有以下幾種（如圖 所示）：①納米聚合物藥物載體 ，包括：聚合物納米粒（納米囊和納米球）納米樹突狀聚合物和聚合物膠束②納米脂質(zhì)體藥物載體，③納米病毒藥物載體，④碳納米管 [22]。隨著納米技術(shù)向醫(yī)學(xué)界不斷滲透，納米技術(shù)在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用，特別在腫瘤的診斷和治療方面，受到了廣泛的關(guān)注 [17]。納米材料具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸 效應(yīng)，表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)四大效應(yīng)。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 3 納米藥物載體在腫瘤治療中的應(yīng)用 納米技術(shù)的研究進(jìn)展 早在 1959 年，著名物理諾貝爾獎(jiǎng)獲得者 Feynman 就預(yù)言了納米科技的出現(xiàn)及前景。因此， SeC 是一種新型高效的抗腫瘤藥物。 圖 硒代胱氨酸的結(jié)構(gòu)式 硒代胱氨酸的抗癌作用 SeC，是一種天然存在的含硒氨基酸，在化學(xué)預(yù)防與治療方面具有巨大的潛力。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 2 硒代胱氨酸的研究現(xiàn)狀 硒代胱氨酸的性質(zhì) 硒代氨基酸在有機(jī)硒化合物中，有特殊的重要性。無機(jī)硒具有較好的抗癌活性，但無機(jī)硒化合物脂溶性差，不易進(jìn)入細(xì)胞，且具有蓄積毒性和致突變作用，限制了它在臨床上的應(yīng)用。根據(jù)硒在自然界的存在形態(tài)，硒化合物可分為無機(jī)硒和有機(jī)硒化合物 [10]。硒可以保護(hù)心臟、肝臟等免受損傷，對(duì)癌癥、心血管疾病、艾滋病等起到治療和控制作用 [57]。 1975 年Awasthi 等人首次明確指出，硒是人體必需的微量元素 [4]。 1817 年，硒由瑞典學(xué)者 Berzelius 發(fā)現(xiàn)，并命名為 Selenium。 關(guān)鍵詞 ：殼聚糖 納米粒子 ；乳化交聯(lián)法；硒代胱氨酸； 體外抗腫瘤活性 暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文 II Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystineloaded chitosan nanoparticles Abstract Selenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid, has been shown to be a novel pound with broadspectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improve drug stability as well as anticancer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biopatible, biodegradable and nontoxic properties. In this paper, Chitosan loaded SeC nanoparticles were prepared in emulsion by using glutaraldehyde as crossing agent, span80 as emulsifier and paraffin as oil phase. Lastly, it’s proved that chitosan nanoparticles loaded SeC had greater toxicity and antitumor activity to MCF7. Key words: Chitosan nanoparticles。高分子載藥 納米粒子 是近年來發(fā)展起來的新劑型，藥物經(jīng)其包裹后，不僅可以提高藥物穩(wěn)定性，而且還可以大大提高藥物的生物利用率。然而， SeC 進(jìn)入腫瘤細(xì)胞與其作用需要較長(zhǎng)一段時(shí)間，細(xì)胞滲透性較差。最后通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，表明以殼聚糖 納米粒子 為藥物載體能夠增強(qiáng) SeC 對(duì) MCF7 乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，并增強(qiáng)其 體外抗腫瘤活性 。 in vitro anticancer activity 暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文 III 目 錄 摘 要 .........................................................................................................