【正文】 限公司） ； 透析袋（ MEMBRACEL，截留分子量為 500/1000/5000Da） ； 安捷倫 1260 凝膠滲透色 譜 儀 (美國安捷倫科技公司 )； Nicolet TM iSTM10 傅立葉變換紅外光譜儀（ Thermo， USA） ； SHZD（ III）型循環(huán)水式真空泵 （ 河南鞏義市英峪豫華儀器廠 ）； FD1A50 型冷凍干燥機 （ 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司 ） ； SARTORIUS 精密分析天平 （ 德國 SARTORIUS 公司 ） ； HitechKflow純化水系統(tǒng)（ 上海和泰儀器有限公司 ）； Anke GL20911 型高速離心機 （ 上海安亭科學(xué)儀器廠 ）； DHG9030A型 電熱恒溫 鼓風(fēng)干燥箱 （上海精 宏 實驗設(shè)備有限公司 ） ； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ IKA RV/HB digital） ； 實驗方法 α殼聚糖的降解 [75] 稱取 α殼聚糖 12g，分子量為 1160kDa、脫乙酰度為 82%，溶解于 400mL濃度為 2%的冰乙酸溶液（體積濃度），攪拌溶解直至獲 得澄清、均質(zhì)的 α殼聚糖 溶液 。 低分子量 α殼聚糖抗新城疫病毒效果研究 [1, 73, 76] A) 新城疫病毒毒力測定 EID50的測定： 取雞胚 30 枚，分 6 組，分別注射 10 10 10 10 10 109病毒原液 生理鹽水稀釋液 ， 37℃ 孵育 72 小時后收取尿囊液，測定 EID50=，取 150EID50≈ 106 為 病毒注射量。 低濃度直接抑制試驗：分別將分子量為 992 837 451 276 262239 196 1729Da 的 α殼聚糖用生理鹽水配置成 1g/L 的溶液，抽濾除菌后，備用。同時將空白組注射生理鹽水，陽性對照為 1g/L利巴韋林與病毒 1:1 混合液，陰性對照為 106 雞新城疫病毒與生理鹽水 1:1 混合液。 高濃度直接抑制試驗：分別將分子量為 992 837 451 276 262239 196 1729 Da 的 α殼聚糖用生理鹽水配置成 10g/L 的溶液，加乙酸促進溶解， 使 乙酸 終 濃度為 1%。采用碘伏對雞胚氣室外殼進行消毒后， 再用 75%酒精消毒，打孔器打孔后注射 18 組溶液 。72h后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。 取 911 日齡 SPF 雞胚，用照蛋器觀察雞胚存活情況并畫出氣室 ，確定打孔位置。蠟封，避免感染，放置于 37℃ 孵育箱孵育 72h。 120xxr/min離心 10min，分管取上清液 600μL，加異丙醇 800μL，顛倒混勻， 20℃ ，沉淀 30min。 B)反轉(zhuǎn)錄：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按要求取上下游引物各 1μL， RNasefree Water 6μL分別加入到各管中， 65℃ 孵育 5min后冰浴 2min，然后再加入其它反應(yīng)組分。 結(jié)果與討論 α 殼聚糖 的制備及表征 通過紅外表征及分子量的測定證明通過微波輔助方法，我們成功制得了分子量分別為 992 837 451 276 262 239 196 1729Da 的 α殼聚糖 ，且由紅外譜圖可以發(fā)現(xiàn)，微波輻射對不同分子量 α 殼聚糖 的結(jié)構(gòu) 沒有破壞 。 （如果那幾個分子量的都做了譜圖的話，最好組合到一起，都做上） α殼聚糖 對 新城疫病毒 的抑制作用 將注射雞新城疫病毒和不同分子量、不同濃度的 α殼聚糖的 1:1 混合液作為直接抑制病毒組；先注射不同濃度、不同分子量的 α殼聚糖， 3h后接種新城疫病毒的實驗組為預(yù)防作用組。但是在更小的分子量組分中，并沒有 出現(xiàn) 抗病毒效果的繼續(xù)優(yōu)化，反而略有下降，可能抗病毒效果不僅與分子量大小有關(guān)系，更與降解后小片段的多糖結(jié)構(gòu)等有致謝 關(guān)。 直接抑制病毒組中低濃度 α殼聚糖表現(xiàn)出比高濃度 α殼聚糖更好的抗新城疫病毒活性，可能是由于高濃度的 α殼聚糖引入乙酸 解決溶解度問題 后反而影響了其抗病毒活性的釋放，或者對機體造成了一定的損傷。 因此我們進一步確定了最佳的分子量在 5kDa 左右的 α殼聚糖具有相對較好的抗病毒綜合效果，作為我們今后進一步研究的重點。 在不同實驗方式下 ，最佳抗病毒效果出現(xiàn)時，殼聚糖分子量略有不同。因此， 我們希望通過氨基基團的引入，增加殼聚糖 上 活性氨基的 數(shù)量 ，從而提高殼聚糖的結(jié)合 活性 和反應(yīng)性能，探討殼聚糖活性開發(fā)的 另一 可行性途徑。 OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司） ； 熒光定量試劑盒（ TransStart174。反復(fù)洗滌后固體冷凍干燥 ，得 灰白 色 固體 。 B) 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 安全限度測定： 將待實驗的 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶恰?6氨乙胺基 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?、 6胺取代 6脫氧殼聚糖配成20g/l、 10g/l、 5g/l的溶液分別注射于 SPF 雞胚尿囊腔中 ， 96 小時內(nèi)完全成活，繼續(xù)培養(yǎng)至出殼，雞胚外觀健康完整，無殘疾。采用 碘酊 對雞胚氣室外殼進行消毒后，再用 75%酒精消毒，打孔器打孔后注射 112 組溶液 。每隔 8 小時觀察雞胚存活情況，將 24h 內(nèi)死亡雞胚剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時抽取進行血凝試驗。 取 911 日齡 SPF 雞胚，用照蛋器觀察雞胚存活情況并畫出氣室，確定打孔摘要 27 位置。每隔 8 小時觀察雞胚存活情況，將 24h 內(nèi)死亡雞胚剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時抽取進行血凝試驗。 120xxr/min 離心 10min。分別為 10μL2TS Reaction Mix， 1μLTransScript RT/RI Enzyme Mix，1μLgDNA Remover，輕輕混勻， 42 ℃ 孵育 30min。 致謝 圖 31 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶牵?NPC）和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖(6BrNPC)的紅外譜圖。我們對不同濃度的 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶巧睇}水溶解液進行了最低有效濃度的測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過 24h充分 溶解后， N鄰苯二甲酰基殼聚糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶堑挠行п尫帕吭?1g/L時，即可全部治愈攜帶新城疫病毒的雞胚。 本文 采用不同溶劑溶解殼聚糖胺代衍生物，對不同溶劑對生物活性的釋放影響進行了評估，并最終采用生理鹽水作為有效溶劑對殼聚糖胺代衍生物進行溶解釋放，發(fā)現(xiàn)其對新城疫病毒具有很好的抑制作用。這 表明以上兩種物質(zhì)對于機體的影響可能 與 低分子量 α殼聚糖有所不同， 但 對免疫系統(tǒng) 也有一定的 活 化 效果。 然而，魷魚骨 卻是重要的 海洋資源 ——β殼聚糖的主要來源 [78]。此外 ， JUNG等 研究發(fā)現(xiàn) ， 構(gòu)型的不同是影響殼聚糖抗菌活性 [80, 81]和 抗氧化活性 [82]的重要因素 ； β殼聚糖 具有更好的保水性和保 濕 性； %的 β殼聚糖比 %的 α殼聚糖對雞蛋具有更好的保鮮效果 [83]； 同樣條件下， β甲殼素脫除 70%的乙?；枰?1h，而 α甲殼素則需要 6h來實現(xiàn)這一反應(yīng) [84]。 實驗結(jié)果表 明 β殼聚糖具有明顯優(yōu)于 α殼聚糖的抗病毒活性，可開 發(fā)成抗病毒類獸藥。證實由堿液方法制備的 β殼聚糖并沒有發(fā)生構(gòu)型的變化，且安全可食用。 通常 β殼聚糖較 α殼聚糖 具有相對弱的 分子間作用力 ， 因而 溶解性、反應(yīng)活性和對溶劑的親和性 更好 [79]。作為殼聚糖衍生化修飾產(chǎn)物， N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶羌捌滗宕苌镌诳共《痉矫婢哂泻軓姷难邪l(fā)和應(yīng)用潛力。經(jīng)過熒光定量 PCR實驗發(fā)現(xiàn)， N鄰苯二甲?；鶜ぞ?糖和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖能有效降低尿囊液中病毒 RNA含量。因此，我們選其進行熒光定量 PCR測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與低分子量殼聚糖不同的是注射 N鄰苯二甲酰基殼聚糖及其溴代衍生物治療后的雞胚尿囊液中雞新城疫病毒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后 cDNA含量明顯降低，免疫因子中 TLR IL8 降低，IFNβ和 IFNα轉(zhuǎn)錄增加。以病毒血凝效價 ≤7為可治愈率，結(jié)果如下表： 摘要 29 表 31 不同溶劑中 6胺代 6脫氧殼聚糖的抗新城疫病毒效果研究 化合物名稱 治愈率 濃度 NPC（ %） 6BrNPC（ %） 6ANPC（ %） 6AC（ %） 黃芪多糖 N P D N P D N P D N P D 10g/L 100 75 20 100 0 60 0 20 20 0 0 0 0 5g/L 100 40 40 100 0 20 0 0 0 0 20 0 20 1g/L 60 0 20 100 0 40 0 0 0 0 0 0 0 結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖胺代衍生物中 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?，能有效降低雞胚尿囊液中的新城疫病毒血凝效價，使病毒效價由無藥物治療組的 11 降低至 0，治愈率可達 100%。 ② 94℃ 5sec、 5060℃ 15sec、 72℃ 10sec，循環(huán)數(shù)為 50。低速離心，將槍頭置于核酸相反的位置吸出殘余液體。 熒光定量 PCR分子實驗 ： A） 病毒 RNA 提?。?取 10g/L 的 NPC 和 6BrNPC 處理過的雞胚尿囊液和陰性對照組雞胚尿囊液各 400μL于不同 離心管中，各加 600μL裂解液顛倒混勻后加 400μL氯仿，編號，顛倒混勻（ 10次左右）后放置 20℃ 沉淀 10min。陰性對照為 106 雞新城疫病毒與生理鹽水 1:1 混合液。 有效濃度的 測定 ： 分別將 抗新城疫病毒效果較好的 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶牵?NPC）和 6脫氧6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?（ 6BrNPC） 配置成 、 、 、1g/L、 5g/L、 8g/L、 10g/L 的生理鹽水溶解液，抽濾除菌后，備用。陰性對照為 106 雞新城疫病毒與生理鹽水 1:1 混合液。將 LASOTA 雞新城疫病毒用生理壓水稀釋為 106 后，以 1:1 的比例與 NPC、 6BrNP、 6ANPC 和 6AC 混勻，編號為 112 組，備用。醇沉 離心后冷凍干燥 的棕 色固體。 B） 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖 的制備 (6BrNPC) 稱取 分散至 337mLN甲基 2 吡咯烷酮中 ，冰水浴 下 加入 ， 80℃ 反應(yīng) 2 小時 ， 醇沉抽濾 、 洗滌烘干得棕黑色顆粒。我們對制備 過程中 一系列的 中間產(chǎn)物 也 一并進行了抗 新城疫 病毒活性篩選 ，希望 在更大范圍內(nèi)尋找 抑制新城疫病毒的可能 的 獸藥 前體 。 通過血凝試驗測定病毒血凝效價以及熒光定量 PCR方法測定相關(guān)免疫因子的基因表達，證實低分子量段的 α殼聚糖可通過提高體內(nèi)免疫系統(tǒng)的相關(guān)反應(yīng)機制，對新城疫病毒起到良好的抑制作用。 本章小結(jié) 采用 過氧化氫輔助微波降解殼聚糖的方法制備 不同分子量 的殼聚糖，并以不同濃度的低分子量 α殼聚糖作為實驗原料，系統(tǒng)化的研究了分子量對 α殼聚致謝 糖抗新城疫病毒效果的影響。 以 βactin 為內(nèi)參，采用 2ΔΔCT 法 計算 IL TNFα熒光定量 PCR結(jié)果的差異： 表 21 部分免疫因子 Ct 值 免疫因子 病毒組 Ct 值 實驗組 Ct 值 病毒組 ΔCt值 實驗組 ΔCt值 ΔΔCt IL2 TNFα βactin 通過熒光定量 PCR方法測定雞胚尿囊液中相關(guān)免疫因子的基因表達量變化顯著，表明低分子量 α殼聚糖能夠顯著提高 IL TNFα等免疫因子的表達，從而激發(fā)免疫系統(tǒng)的抗病毒反應(yīng)，提高家禽免疫力，從而有效抑制新城疫病毒的發(fā)病及擴散。 對 10g/L高濃度的殼聚糖溶解過程中，由于低分子量殼聚糖中， 5kDa 以上的 α殼聚糖不能達到完全溶解，因此我們添加 1%的乙酸促進溶解。 這與之前相關(guān)的海洋多糖研究一致 ， 在一定范圍內(nèi)，硫酸化多糖的抗病毒效果隨著分子量降低而增大。 圖 21 分子量為 4513Da 的 α殼聚糖的高效液相色譜圖。 85℃ 加熱 5min失活TransScript RT與 gDNA Remover C)熒光定量 PCR：采用 PCR試劑盒，按要求取 8μLtemplate，上下游引物各 1μL， 10μL 2TransStart Top Green qPCR SuperMix設(shè)置步驟為 ① 94℃ 30sec，循環(huán)數(shù)為 1。傾倒離心管上清，將管口向下置于吸水紙上，停留 510s，沿離心管壁加入冷乙醇（ 75%） 1000μL，沖洗 12 次。 72h后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。同時將空白組注射生理鹽水，陽性對照為 10g/L利巴韋林，陰性對照為生理鹽水。 高濃度預(yù)防實驗：分別將分子量為 992 837 451 276 262 239196 1729Da 的 α殼聚糖用生理鹽水配置成 10g/L 的溶液，加乙酸使其溶解完全，乙酸 終 濃度為 1%。蠟封，避免感染，放置于 37℃ 孵育箱孵育 72h。將 L