【正文】 6。每隔 8 小時(shí)觀察雞胚存活情況，將 24h內(nèi)死亡雞胚致謝 剔除，并將死亡雞胚的尿囊液及時(shí)抽取進(jìn)行血 凝試驗(yàn)。 分子實(shí)驗(yàn)方法 A) 病毒 RNA提取： 取 1g/L,分子量為 4513Da 的 α 殼聚糖處理過(guò)的雞胚尿囊液和陰性對(duì)照組雞胚尿囊液各 400μL于不同 ， 提取病毒 RNA：取 10g/L分子量為 4513Da 的 α殼聚糖作用后的雞胚尿囊液 400μL于 心管中，加 600μL裂解液顛倒混勻后加 400μL氯仿，編號(hào)，顛倒混勻（ 10 次左右）后放置 20℃ 沉淀 10min。 120xxr/min 離心 10min。低速離心，將槍頭置于核酸相反的位置吸出殘余液體。分別為 10μL2TS Reaction Mix， 1μLTransScript RT/RI Enzyme Mix，1μLgDNA Remover，輕輕混勻， 42℃ 孵育 30min。 ② 94℃ 5sec、 5060℃ 15sec、 72℃ 10sec，循環(huán)數(shù)為 50。摘要 19 且微波輔助方法簡(jiǎn)單可行，原料制備方便且不引入化學(xué)有毒物質(zhì)，具有很好的應(yīng)用前景 ，尤其是工業(yè)大范圍應(yīng)用 。 （譜圖也都附上） 圖 22 為分子量為 4513Da 的 α殼聚糖紅外譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 隨著分子量的降低， α殼聚糖的抗病毒效果呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì) ， 當(dāng)分子量在 4kDa10kDa 時(shí)， α 殼聚糖表現(xiàn)出較好的 抗新城疫病毒的效果 ，且分子量為 4513Da 時(shí)效果 最為 顯著。因?yàn)榉肿恿枯^小的組分具有更好的水溶性，且往往更易進(jìn)入細(xì)胞。 圖 23 低濃度低分子量 α殼聚糖直接抑制病毒作用 圖 24 高濃度低分子量 α殼聚糖直接抑制病毒作用 抗病毒血凝試驗(yàn)中，低分子量 α殼聚糖表現(xiàn)出了更好的抗新城疫病毒的效果，經(jīng) SPSS 假定方差齊性， LSD分析得 分子量分別為 992 837 4511729Da 的低濃度 α殼聚糖直接抑制作用組與陰性對(duì)照組具有極顯著性差異（ P≤），分子量為 1968Da 時(shí) ，具有 顯著 性差異 （ P≤） 。然而， 殼聚糖在酸性溶液中能逐漸水解，粘度降低并最終生成葡萄糖胺，所以使 用時(shí)應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用 [27]。 摘要 21 圖 25 高濃度低分子量 α殼聚糖預(yù)防作用 取血凝試驗(yàn)中，抗病毒效果最好的低濃度的分子量為 4513Da 的 α殼聚糖處理后雞胚尿囊液為實(shí)驗(yàn)原料， 進(jìn)行熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)病毒本身的RNA 并未降低，但 IL TNFα等免疫相關(guān)因子 RNA 顯著增多 。這為低分子量 α殼聚糖成為防治抗新城疫病毒藥物的研究打下了很好的基礎(chǔ)。 并努力 提高 低分子量 殼聚糖的溶解度 ， 使其在生理鹽水溶解狀態(tài)下，達(dá)到較高的藥效濃度 。采用不同濃度、不同 給藥方式 對(duì)分子量范圍為10kDa1kDa 的 α殼聚糖進(jìn)行雞胚藥效實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置直接抑制病毒組和預(yù)防作用組， 結(jié)果 發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)方式的不同、 α殼聚糖分子量和濃度的不同都會(huì)影響其對(duì)新城疫病毒的抑制效果， 同時(shí)注射新城疫病毒和 α殼聚糖的抑制作用組比預(yù)防作用組具有更好的抑制病毒效果，且 低濃度的最佳分子量段的 α殼聚糖對(duì)新城疫病毒的直接抑制效果顯著高于高濃度的 α殼聚糖， 確定了 α殼聚糖的最佳使用方式 和優(yōu)化濃度 。直接抑制病毒的最佳分子量段為 104kDa；預(yù)防作用組的最佳分子量段為 8kDa3kDa。 摘要 23 第 三 章 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物抑制新城疫病毒的活性研究 雖然 低分子量 α殼聚糖 經(jīng)生理鹽水溶解后表現(xiàn)出了 顯著 的 抗新城疫病毒 活性 ， 但是通過(guò)其血凝效價(jià)的測(cè)定 數(shù)據(jù)， 簡(jiǎn)單的殼聚糖降解 雖然具有提高免疫 、抑制病毒的 效果 ， 卻 不能滿足 治療 新城疫 病毒的 要求。 通過(guò)多保護(hù)基團(tuán)和去保護(hù)基團(tuán)制備的 6胺代 6脫氧殼聚糖在 6 位羥基上成功引入氨基基團(tuán)， 使得酸性條件下殼聚糖帶有更多的正電荷，能更好作用于細(xì)胞，釋放其 抗病毒 、 抗菌等 生理活性 。 實(shí)驗(yàn)原料 原料 殼聚糖原料（青島百誠(chéng)生化有限公司，脫乙酰度為 82%分子量為 1160kDa）； SPF 雞胚（ 山東無(wú)特定病原雞實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng)，符合 GB/ 以及國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn) ） ； 試劑 乙二胺（ 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ）； N溴代 丁二酰亞胺（ 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ）； 三苯基膦（ 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ）； 生理鹽水（ 醫(yī)用 %氯化鈉，不含葡萄糖 ） 磷酸緩沖液 PBS（ ， USA） ； 二甲亞砜 (實(shí)驗(yàn)專用， )； 致謝 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ TransScript174。 Top Green qRTPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司） ； 病毒（ LASOTA 雞新城疫病毒，原始病毒效價(jià)為 211， 96h 內(nèi) 致雞胚死亡） ； 儀器 Nicolet TM iSTM10 傅立葉變換紅外光譜儀（ Thermo， USA）； SHZD（ III）型循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪豫華儀器廠）； FD1A50 型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）； SARTORIUS 精密分析天平（德國(guó) SARTORIUS 公司）； HitechKflow純化水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）； Anke GL20911 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； DHG9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ IKA RV/HB digital） ； 試驗(yàn)方法 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 的制備 [77] A） N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶堑闹苽?（ NPC） 稱取 3g殼聚糖 于三口燒瓶中， 加入 60mL 二甲基甲酰胺（ 含 5%的 水） ， 均勻 溶散后 加 入 8g鄰苯二甲 酸酐， 120℃ 攪拌回流 8h，反應(yīng)物傾倒于 冷水中減壓過(guò)濾 ，洗滌烘干后 得 棕色粉末狀固體。 C） 6氨乙胺基 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?的制備 （ 6ANPC） 稱取 1g 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖于 26mL 乙二胺中， 80℃ 反摘要 25 應(yīng) 24h后倒入異丙醇中，離心。 D） 6胺取代 6脫氧殼聚糖 的制備 （ 6AC） 稱取 6氨乙胺基 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶? 25mLN甲基 2吡咯烷酮和 25mL 水合肼 （ 80%）中 ， 100℃ 回流 4h。 圖 31 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物的合成路線 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物抗新城疫病毒 活性 研究 A) 新城疫病毒毒力測(cè)定 EID50的測(cè)定 ： 取 SPF 雞胚 30 枚，分成 6 組，分別注射 10 10 10 10 10 109雞新城疫 LASOTA 病毒生理鹽水稀釋液， 37℃ 孵育 72h 后收取尿囊液，測(cè)定致謝 EID50=,取 150EID50≈ 106 為 病毒注射量。 C)不同溶劑中 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 直接抑制新城疫 病毒活性研究 分別將 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶牵?NPC）和 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖 (6BrNPC)、 6氨乙胺基 6脫氧 N鄰苯二甲酰基殼聚糖（ 6ANPC）、 6胺取代 6脫氧殼聚糖（ 6AC）配置成 1g/L、 5g/L、 10g/L 的生理鹽水（ N）、 PBS（ P）、二甲亞砜（ D）溶解液，抽濾除菌后，備用。 取 911 日齡 SPF 雞胚，用照蛋器觀察雞胚存活情況并畫(huà)出氣室，確定打孔位置 。同時(shí)將空白組注射生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照 3組分別為 1g/L、 5g/L、 10g/L 黃芪多糖生理鹽水溶解液與病毒 1:1 混合液。蠟封，避免感染，放置于 37℃孵育箱孵育 72h。 72h 后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。將 LASOTA雞新城疫 病 毒稀釋為 106 后，以 1:1 的比例與 NPC 和 6BrNPC 混勻，編號(hào)為 114 組，備用。采用 碘酊 對(duì)雞胚氣室外殼進(jìn)行消毒后，再用 75%酒精消毒，打孔 器打孔后注射 16 組溶液 。蠟封，避免感染，放置于 37℃ 孵育箱孵育 72h。 72h后將所有活胚置于 20℃ ，冷凍 。120xxr/min 離心 10min，分管取上清液 600μL，加異丙醇 800μL，顛倒混勻， 20℃ ，沉淀 30min。傾倒離心管上清，將管口向下置于吸水紙上，停留 510s，沿離心管壁加入冷乙醇（ 75%） 1000μL，沖洗 12 次。 B） 反轉(zhuǎn)錄：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按要求取上下游引物各 1μL， RNasefree Water 6μL分別加入到各管中， 65℃ 孵育 5min 后冰浴 2min，然后再加入其它反應(yīng)組分。 85 ℃ 加熱 5min 失活TransScript RT與 gDNA Remover C） 熒光定量 PCR：采用 PCR試劑盒，按要求取 8μLtemplate，上下游引物各 1μL， 10μL 2TransStart Top Green qPCR SuperMix設(shè)置步驟為 ① 94℃ 30sec，循環(huán)數(shù)為 1。 結(jié)果與討論 我們采用 KBr 壓片法對(duì) NPC、 6BrNPC、 6ANPC、 6AC 進(jìn)行了紅外表征，證明 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物制備成功。 （紅外譜圖附全 ， A和 B代表什么寫(xiě)清楚 ） 我們分別將 NPC、 6BrNPC、 6ANPC 和 6AC 配置成 1g/L、 5g/L、 10g/L的生理鹽水（ N）、 PBS（ P）、二甲亞砜（ D）溶解液，測(cè)定其抗新城疫病毒效果。尤其當(dāng)試驗(yàn)樣品為由生理鹽水配制的，抗病毒效果明顯好于其他溶劑， PBS 溶解液次之，二甲亞砜溶劑溶液抗病毒效果最弱。 表 32 不同濃度 NPC、 6BrNPC 生理鹽水溶液的抗新城疫病毒效果研究 濃度 治愈率 (%) 化合物名稱 g/L L g/L 1 g/L 5 g/L 8 g/L 10 g/L NPC 0 0 0 100 100 100 100 6BrNPC 0 0 80 100 100 100 100 10g/L的 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?10g/L的 6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶侨芤耗苡行Ы档筒《镜难r(jià)，使病毒效價(jià)由無(wú)藥物治療組的 11 降低至 0。以 βactin為內(nèi)參，采用 2ΔΔCT 法 計(jì)算 TLR3 和 IL8降低，而 IFNβ、 TFNα增加的熒光定量 PCR結(jié)果的差異： 表 33 部分細(xì)胞因子 RTPCR 實(shí)驗(yàn)中 Ct 值 免疫因子 病毒組Ct 值 NPC Ct 值 6BrNPC Ct 值 病毒組ΔCt值 NPC ΔCt值 6BrNPC Ct 值 TLR3 IL8 IFNβ 致謝 TNFα βactin 本章小結(jié) 由于實(shí)驗(yàn)室良好的研究基礎(chǔ) ， 殼聚糖胺代衍生物 已成功 制備，并證實(shí) 具有很好的抗菌作用 ，但未進(jìn)行抗病毒效果研究。經(jīng)過(guò) 生理鹽水 充分溶解的 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖能將病毒血凝效價(jià)由起始時(shí)的 11 降低至 0。同時(shí) TLR3 和 IL8 降低，而IFNβ、 TFN增加 。殼聚糖胺代衍生物 具有 多項(xiàng)優(yōu)異的生物活性，能使抗病毒效果在綜合作用下發(fā)揮最大，且制備簡(jiǎn)單，原材料豐富，作為藥物使用能有效降低毒副作用及相關(guān)生物污染。 摘要 31 第四章 不同 分子量 β殼聚糖 制備 及其 抗新城疫 病毒活性研究 近年來(lái) ， 隨著海洋漁業(yè)的發(fā)展 ，每年都有大量的魷魚(yú)骨 由于其 不可 食用性而被當(dāng)成生產(chǎn)垃圾丟棄 ， 這不僅是對(duì)資源的 浪費(fèi) ，也對(duì)環(huán)境 造成了 污染。 β殼聚糖具有不同于α殼聚糖的平行結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其在制備和性質(zhì)的應(yīng)用上，也與 α殼聚糖有著明顯的差別。 作為 一種可再生的天然多糖 材料， β殼聚糖已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傷口縫合和軟骨損傷等醫(yī)藥領(lǐng)域，能夠促進(jìn)細(xì)胞再生 、 防止疤痕形成。 本 文 對(duì)由日本槍烏賊 （ Loligo Japonica） 的魚(yú)骨 制備 β殼聚糖的工藝進(jìn)行了研究和改進(jìn)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了全面表征，包括元素分析、 FTIR、 HPLC、XRD、 NMR和 AFS 等技術(shù)手段。雖然高分子量、高脫乙酰度的 β殼聚糖具有極好的吸附性和機(jī)械性能，然而，為了增強(qiáng) β殼聚糖的溶解性和生物活性的釋放，我們通過(guò)過(guò)氧化氫輔助微波方法進(jìn)一步降解制得分子量為 10kDa 以下的可溶性β殼聚糖，并對(duì)其抗病毒活性進(jìn)行了直接作用組、預(yù)防作用組 和治療作用組的實(shí)驗(yàn)。 傳統(tǒng)的抗病毒藥物往往存在毒副作用大 、 交叉產(chǎn)生病毒抗藥性等特點(diǎn) [74]，而 β殼聚糖 作為天然海洋生物多糖具有低毒性 、生物