【正文】 。其中，納米藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中控釋緩釋的應(yīng)用極為廣泛，提高藥物的利用率療效和減少藥物的副作用已成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。進(jìn)入 21 世紀(jì)，納米技術(shù)迅速發(fā)展，作為一個(gè)多學(xué)科交叉領(lǐng)域，涉及面廣應(yīng)用十分廣泛。納米，是尺寸度量單位， 1 納米 =109 米，相當(dāng)于 4 個(gè)原子并列的直徑。 μΜ，說明 SeC 不易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞， 對(duì)細(xì)胞的滲透性不強(qiáng)。且 SeC 對(duì)人類正常纖維原細(xì)胞 Hs68 的細(xì)胞毒性很小， IC50400 μΜ，毒性遠(yuǎn)小于亞硒酸鹽。硒代胱氨酸 是胱氨酸分子中 S 被 Se 所取代后的含硒氨基酸 [14]。其中含硒氨基酸 硒代半胱氨酸（ selenocysteine）是生物合成和摻入到蛋白質(zhì)分子中的第 21 種氨基酸[12]。有機(jī)硒主要包括硒多糖，含硒蛋白質(zhì)，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有機(jī)硒化合物。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽過氧化酶（ GSHPx）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在， GSHPx 能減輕或阻斷自由基所致的脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，保護(hù)蛋白質(zhì)、清除自由基和 DNA 及生物膜的完整性，修復(fù)損傷分子部位；同時(shí)能提高機(jī)體免疫能力，抵抗疾病 [9]。 1988 年，我國(guó)已經(jīng)把硒列為膳食營(yíng)養(yǎng)素之一。 1957 年美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家 Schwarz 和 Foltz 首次用硒治療動(dòng)物肝壞死取得成功后，硒逐漸明確為動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素 [2] 。 Selenocystine。本文以殼聚糖為載體，戊 二醛為交聯(lián)劑，液體石蠟為乳化體系，制備出粒徑小，分散性好，載藥率 及包封率較高的 SeC 殼聚糖 納米粒子 。殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性的研究 暨南大學(xué)本科生畢業(yè)論文 I 畢業(yè)論文 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其體外抗腫瘤活性 的研究 摘 要 硒代胱氨酸 (SeC)是一種天然的含硒氨基酸，研究證明， SeC 作為一種新型高效的抗腫瘤藥物在腫瘤化學(xué)預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要的作用。殼聚糖 (CS)是一種優(yōu)良的天然藥物載體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和無毒性 ,被廣泛地用作醫(yī)藥載體。 crosslinking emulsification。但由于毒性，硒曾被認(rèn)為是一種對(duì)高級(jí)生物有害的元素。此后，硒與硒化合物的生理作用受到普遍關(guān)注。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金屬，抗逆境 等多種生物學(xué)活性 [8] 。無機(jī)硒主要包括硒，硒酸鹽 (亞硒酸鈉 ,亞硒酸鋅等 )，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氫，硒化鈉，硒化鉀等）等。而相比之下，有機(jī)硒化合物吸收率高，生物活性強(qiáng)，毒性低和環(huán)境污染小，不僅能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上也比無機(jī)硒顯著，抗癌作用更強(qiáng) [11]。在哺乳動(dòng)物組中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸 (SeCys) 和硒代蛋氨酸 (SeMet)。 Chen等 [15]通過實(shí)驗(yàn)比較幾種含硒化合物對(duì)八種人類癌癥細(xì)胞的抗癌活性，實(shí)驗(yàn)證明， SeC 與亞硒酸鹽對(duì) A375， MCF7， HepG2， SW620 等癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸鹽等強(qiáng)。 雖然 SeC 作為抗腫瘤藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但是從 Chen 等 [16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SeC 的水溶性與穩(wěn)定性較差， 進(jìn)入 MCF7 細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)間比較長(zhǎng)， 36 h 之后才觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，且 72 h 后的 IC50=177。1990 年 7 月，在美國(guó)巴爾的摩召開了第一界國(guó)際納米科技會(huì)議，標(biāo)志著納米科技的正式誕生。當(dāng)物體達(dá)到納米級(jí)后，納米粒子在熱學(xué)、光學(xué)、磁學(xué)力學(xué)及電化學(xué)方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì) [18]。納米技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在一下幾個(gè)方面：控釋載藥微粒，靶向載藥微粒，磁導(dǎo)航靶向載藥微粒，基因載體 [20]。雖然，納米藥物載體作為載藥系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問題，如生物相容性以及細(xì)胞毒性等。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他親水性生物可降解聚合物 [23]。蛋白質(zhì)一般包括如明膠，白蛋白，絲蛋白等物質(zhì)，多糖類一般包括如殼聚糖，海藻酸 鈉，環(huán)糊精，果膠等物質(zhì)。殼聚糖的化學(xué)名稱為 (14)2氨基 2 脫氧 D葡聚糖，甲殼素的化學(xué)名稱為 (14)2乙酰胺基 2 脫氧 D葡聚糖 [27]。它不溶于水和有機(jī)溶劑，但是能溶于 PH 的乙酸（ 13 %）溶液中 [28]。其中，殼聚糖 納米粒子 載藥體系比其他體系更具優(yōu)勢(shì)。 (1)乳化交聯(lián)法 乳化交聯(lián)法是制備殼聚糖 納米粒子 的常用方法之一。操作流程如圖 。其操作流程如圖 。 圖 噴霧干燥法操作流程 (3)逐層自組裝 逐層自組裝法適用于制備球壁厚度可控的空心 納米粒子 。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 8 圖 逐層自組裝反應(yīng)流程 (4)界面聚合法 界面聚合法是將含有親水性單體溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有機(jī)溶劑中，然后加入溶于該有機(jī)溶劑的疏水性單體（多元酰氯，多元硫酰氯，多異氰酸酯等），使兩種單體在水 /油界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)形成聚合物球殼。制備的方法是將用高壓空氣將殼聚糖溶液吹入堿性溶液如氫氧化鈉，氫氧化鈉甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成 納米粒子 ，如圖 所示。 圖 沉淀法反應(yīng)示意圖 (6)其他制備方法 制備殼聚糖 納米粒子 的方法還有很多。常見的殼聚糖 納米粒子 制備方法還有離子凝膠法，反膠束法，殼聚糖包裹法和殼聚糖 納米粒子 乙?；ǖ?[33]。 Hejazi 等采用乳化交聯(lián)法制備了包載四環(huán)素的殼聚糖 納米粒子 。 Wang 等制備了殼聚糖胰島素 納米粒子 ，其包封率高達(dá) 70%，胰島素的化學(xué)穩(wěn)定性大于 95%，并且胰島素可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定釋放。 (4)降低藥物的毒副作用，提高療效 載有藥物的殼聚糖 納米粒子 循血液循環(huán)到達(dá)靶區(qū)周圍釋放藥物，使靶區(qū)周圍很快達(dá)到有效的治療藥物濃度，而在機(jī)體其他部位藥物的分布量較小，從而減少了對(duì)機(jī)體正常組織的毒副作用，同時(shí)由于載體殼聚糖本身具有一定的生理活性，且無毒，與藥物可產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)療效。 Mooren 等研究了潑尼松龍磷酸鈉殼聚糖 納米粒子 通過上皮細(xì)胞膜的情況，結(jié)果表明，殼聚糖 納米粒子可以改善上皮細(xì)胞膜對(duì)疏水性藥物通透性。殼聚糖屬親水性聚合物，可制得不同大小的 納米粒子 ，將疫苗，蛋白質(zhì)，抗生素類藥物制成 納米粒子 系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)的快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能將藥物緩慢釋放并靶向送達(dá)體內(nèi)的作用部位，從而達(dá)到長(zhǎng)效緩釋靶向的目的。目前癌癥化學(xué)預(yù)防研究的主要目標(biāo)就是尋找高效低毒，作用機(jī)制明確的化學(xué)預(yù)防藥物。本文通過乳化交聯(lián)法制得殼聚糖 納米粒子 載體負(fù)載硒代胱氨酸，并對(duì) MCF7 進(jìn)行 體外抗腫瘤活性 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖能夠增強(qiáng)硒代胱氨酸對(duì) MCF7 的細(xì)胞毒性，并在較短的時(shí)間內(nèi)起作用。玻璃儀器均經(jīng)超聲清洗 40 分鐘，所有反應(yīng)均在室溫中 （ 25 ℃ ） 進(jìn)行。激光粒度分析法是根據(jù)激光照射到顆粒后，顆粒能使散射的激光產(chǎn)生衍射或散射的現(xiàn)象來測(cè)試粒度分布的。測(cè)試范圍下限可達(dá)到 1 nm，可測(cè)懸浮液、乳濁液、微乳液等體系。本論文研究中以 TEM 觀察殼聚糖納米材料的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)將選取不同殼聚糖溶液濃度，不同油水比，不同的表面活性劑用量殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 14 以及不同的交聯(lián)劑用量，不同的油相體系，篩選出制備殼聚糖納米粒子的最佳工藝條件，用以后續(xù)的載藥制備。（ CSNPs）。（ CSNPs）。（ CSNPs）。（ CSNPs）。（ CSNPs）。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 16 表 23 油相體系比對(duì) 納米粒子 粒徑的影響 Table 23 Effect of different oil phase on nanoparticles39。隨著油水相體積比增大，水殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 17 相 納米粒子 能夠被較厚的油相膜隔離開，降低了在超聲分散過程中 納米粒子 粘連的幾率，從 PdI和粒徑分布圖看出，油水相體積比增大，粒徑分布更加均勻，粒徑減小。 sizes (A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 (2) TEM 分析 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 19 TEM（ TEANAI10 型透射電子顯微鏡， philips） 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。這可能是由于油相體積較小，乳化時(shí)殼聚糖溶液無法形成規(guī)則乳滴，造成交聯(lián)固化后的產(chǎn)物不規(guī)則。從表跟圖中可以看出，當(dāng) span80 用量為油相體積的 3%時(shí)，殼聚糖 納米粒子 的粒徑最小。隨著乳化劑用量的增加，界面膜厚度和強(qiáng)度逐漸增加，過量會(huì)導(dǎo)致膜層太厚，不容易交聯(lián)，后續(xù)的洗滌也變得困難。 sizes 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 21 B 1B 2B 3B 4B 5 圖 不同 Span80 用量 納米粒子 的粒徑分布 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。這可能是由于乳化劑過少或過多造成乳滴界面膜不穩(wěn)定，表面不均勻，存在凹陷，造成在 TEM 成像時(shí)的襯度太低，以致觀察不到物像，故需要磷鎢酸染色。 shapes of different Span80 dosage (B1) 2% (B2) 3% (B4) 5% 殼聚糖濃度對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 26 與圖 是不同殼聚糖濃度對(duì)殼聚糖納米粒子粒徑的影響。隨著殼聚糖溶液濃度的增加，產(chǎn)物的粒徑也增加，分散性變差，且顏色加深，由白色逐漸變成棕黃色。 sizes 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 24 C 1C 2C 3C 4 圖 不同殼聚糖濃度的 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。殼聚糖濃度較小，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)松散。 shapes of different CS concentration (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL 交聯(lián)劑用量對(duì)殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 從表 27 與圖 可以看出當(dāng)交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，改變交聯(lián)劑的體積對(duì)殼聚糖納米粒子的影響不呈規(guī)律性分布。 sizes No. Glutaraldehyde aq(1%)/ml Size() PdI D1 2 D2 3 D3 4 D4 5 D5 6 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 26 2 3 4 5 604080120160200240280 Size(m)V / m l 圖 不同交聯(lián)劑體積對(duì) 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde volume on nanoparticles39。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。 sizes E 1E 2E 3E 4E 5 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。 shapes of different glutaraldehyde concentration (E1) % (E3) 3% (E5) 7% 本章小結(jié) 通過以上實(shí)驗(yàn)，表明乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子受到幾個(gè)因素的影響 ——不同油相體系，油水相比例，表面活性劑用量，殼聚糖濃度以及交聯(lián)劑用量。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 29 第三章 殼聚糖納米粒子負(fù)載硒代胱氨酸的制備 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)材料 表 31 實(shí)驗(yàn)試劑 Table31 Reagents used in experiment 試劑名稱 規(guī)格 產(chǎn)地 液體石蠟 AR 天津市化學(xué)試劑公司 Span80 CP 天津市化學(xué)試劑公司 殼聚糖 90 % MW=60000 上海伯奧生物科技有限公司 硒代胱氨酸 AR Sigma 公司 戊二醛 (25%) AR 天津市百世化工有限公司 無水乙醇 AR 天津市百世化工有限公司 石油醚 AR 天津市百世化工有限公司 冰醋酸 AR 天津市百世化工有限公司 實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，藥品稱量均使用德國(guó) Sartorius 公司的電子分析天平，誤差為 1