【正文】 tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾 真核 tRNA的基因和原核不同： (1) 真核的前體分子 tRNA是單順反子，成簇排列，基因間有間隔區(qū) 。 （ 3） tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶 ? 以 ATP和 CTP為前體，催化 tRNA（ Ⅱ 型）的 3’端生成 CCA ? CCA末端常丟失，該酶有修復(fù)作用。 不同點(diǎn)： 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 模板 兩條鏈均復(fù)制 模板鏈轉(zhuǎn)錄 （不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄） 原料 dNTP NTP 酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 產(chǎn)物 子代雙鏈 DNA （半保留復(fù)制） mRNA， tRNA， rRNA 配對(duì) AT； GC AU； TA； GC 引物 RNA引物 無 ? 第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄酶 ? 第二節(jié) 啟動(dòng)子 ? 第三節(jié) 終止子 ? 第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄的機(jī)制 ? 第五節(jié) 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 ? 第六節(jié) RNA的剪接 第五節(jié) 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 1 原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工 ? 原核生物 mRNA的壽命比 tRNA 、 rRNA的短，細(xì)菌的 mRNA半衰期只有幾分鐘。 （ 1） 終止子的結(jié)構(gòu) IR序列中的 G／ C 對(duì)含量較少 發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端沒有固定特征 （ 2） 靠與 ρ的共同作用而實(shí)現(xiàn)終止 依賴 ρ因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 無連續(xù) U串 G/C含量較少 （ 3） 終止轉(zhuǎn)錄過程 1）通讀： 在依賴 ρ 因子的轉(zhuǎn)錄終止過程中，RNApol 轉(zhuǎn)錄了 IR序列之后，發(fā)生一定時(shí)間的暫停，沒有 ρ因子存在， RNApol 會(huì)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。 旋轉(zhuǎn)酶 3）轉(zhuǎn)錄速度 （ 1）約 3050bp/s，與蛋白質(zhì)的相近（ 15個(gè) AA/s）。 轉(zhuǎn)錄的機(jī)制 1 起始： 2 延伸： 3 終止： 起始到延伸的轉(zhuǎn)變 ★ 始于第一個(gè)磷酸二酯鍵的形成； ★ RNA聚合酶構(gòu)象變化，對(duì) DNA的親和力也變化。 1 轉(zhuǎn)錄的起始 原核生物轉(zhuǎn)錄的起始 σ 核心酶 12～ 17bp 35區(qū) 移動(dòng)到 10區(qū)，使之熔解 酶與 10區(qū)牢固結(jié)合 （ β亞基） 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始 ? 三種 RNApol識(shí)別不同啟動(dòng)子。 ? 真核生物的 RNA大部分都要經(jīng)過加工，包括剪切和加 poly(A)，很難確定原初轉(zhuǎn)錄物的 3’末端。 ? 轉(zhuǎn)錄終止： ? RNA聚合酶停頓 和 RNA產(chǎn)物脫出 。 ? 當(dāng)有的基因缺少 TATA框時(shí)，可能由 Inr來替代它的作用， ? 無論 TATA是否存在， Inr對(duì)于啟動(dòng)子的強(qiáng)度和起始位點(diǎn)的選擇都是十分重要的 。 － 35 序列與－ 10 序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子 － 35 TTGACA － 10 TATAAT 不同的啟動(dòng)子 a. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子序列同源性越高 → 啟動(dòng)強(qiáng)度越大 b. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子同源性越低 → 啟動(dòng)強(qiáng)度越小 c. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子差異很大時(shí) → 由另一種 σ因子啟動(dòng) 4） 10和 35之間距離： ? 間距非常重要， 1619bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高，堿基序列并不重要 ? 間距上的突變種類： 間距趨向于 17bp → 上升突變 間距遠(yuǎn)離 17bp → 下降突變 原因： ? 該距離大致是雙螺旋繞兩圈的長度。 ? 強(qiáng)啟動(dòng)子與 RNA聚合酶親和性高，合成的 mRNA多，翻譯的蛋白質(zhì)也多。 ? 如環(huán)境溫度升高時(shí)，大腸桿菌會(huì)開啟 rpoH基因的表達(dá)， 其產(chǎn)物 ?32能識(shí)別熱激基因的啟動(dòng)子，而正常狀態(tài)下表達(dá)的基因會(huì)關(guān)閉或表達(dá)水平下降。 組成 ? 大腸桿菌 RNA聚合酶由多亞基組成， α2ββ’ ωσ稱為全酶 , 480 KDa ? ?亞基與全酶結(jié)合疏松，很容易與全酶分離。 ? 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)轉(zhuǎn)錄物為 RNA前體 （ RNA precursor），必須經(jīng)過加工過程變?yōu)槌墒斓腞NA。 不同生物的復(fù)制體系 功能 λ SV40/人 酵母 起始蛋白 DnaA O T抗原 ORC 解旋酶 DnaB DnaB T抗原 MCM 裝配因子 DnaC P T抗原？ Cdc6 引發(fā)酶 DnaG DnaG Polα引發(fā)酶 Polα引發(fā)酶 聚合酶 PolⅢ 的 α亞基 Polδ Polδ,Polε 校正 PolⅢ 的 ε亞基 Polδ Polδ,Polε 滑動(dòng)鉗 PolⅢ 的 ?亞基 PCNA PCNA 滑動(dòng)鉗裝配器 ? 復(fù)合體 RFC RFC 單鏈結(jié)合蛋白 SSB RFA RFA 1）半保留復(fù)制方式 2） 半不連續(xù)復(fù)制 3） DNA 螺旋酶 , SSBP 4） RNA 引物 1） 復(fù)制起點(diǎn)（單、多） 2）復(fù)制子（大小、多少） 3）復(fù)制叉移動(dòng)的速度 4）岡崎片段的大小 5）端粒和端粒酶 6） DNA聚合酶 相同點(diǎn)： 不同點(diǎn)： 原核生物和真核生物 DNA復(fù)制的比較 復(fù)制子的大小 : 酵母 平均 40 kb 脯乳動(dòng)物 平均 100 kb 原核生物 1000 kb 岡崎片段 原核生物 10002023 nt 真核生物 100200 nt 復(fù)制速度 原核生物 50,000bp/min (750/sec) 真核生物 3,000bp/min (50/sec) DNA聚合酶 真核生物 五種， α、 β、 γ、 δ和 ε 原核生物 三種 ， polⅠ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 引物酶作用特點(diǎn) 真核細(xì)胞 DNA引物酶和 polα緊密偶聯(lián)， 原核細(xì)胞 引發(fā)酶和解旋酶偶聯(lián)，形成復(fù)制體的一部分。 ? 模板鏈 , 無意義鏈： 在 DNA的兩條多苷酸鏈中只有其中一條鏈作為模板。 β α σ ω α β ’圖 1 2 5 E . c o l i R N A 聚合酶的亞基組成 各亞基的功能 ? β亞基： 由 rpoB編碼 ， 結(jié)合底物 （ NTP及新生 RNA鏈 ） ， 進(jìn)行聚合作用 。 ? 芽孢菌生活周期過程中生活方式的改變也是通過 ?因子的更替完成的。 ? DNA上開始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基定為 +1， ? 沿轉(zhuǎn)錄方向順流而下的核苷酸序列均用正值表示； ? 逆流而上的核苷酸序列均用負(fù)值表示。這兩個(gè)結(jié)合區(qū)是在DNA分子的同一側(cè)面，此酶結(jié)合在雙螺旋的一面。 小結(jié) 與原核生物啟動(dòng)子的比較： （ 1）多種元件： TATA框， GC框， CAAT框，OCT等； （ 2）不同元件的組合情況： 位置、序列、距離和方向都不完全相同； （ 3）需轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄的全過程 ：轉(zhuǎn)錄因子先和啟動(dòng)子結(jié)合，再與 RNA聚合酶一起形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，開始轉(zhuǎn)錄的過程。 兩種終止子： ? 強(qiáng)終止子 /內(nèi)部終止子 －－無需其它任何因子的幫助就可以終止核心酶 。 ? 終止區(qū)域富含 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) ，也可能有 終止因子 存在。 ? 轉(zhuǎn)錄起始過程需要很多 轉(zhuǎn)錄因子（ transcription factor, TF ）參與，按一定順序與 DNA形成復(fù)合物，協(xié)助 RNA pol定位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。 1）原核生物 Prok. ? 起始后， ζ因子解離 , 核心酶構(gòu)象發(fā)生變化。 （ 2） RNA聚合酶在 DNA上的移動(dòng) 速度不均勻 ，在經(jīng)過富含 的序列 8－ 10個(gè)核苷酸后，發(fā)生暫停，推測這和轉(zhuǎn)錄終止有關(guān)。 2） ρ因子 a. 46KD，活性狀態(tài)是六聚體（ 275KD）。 ? mRNA很容易從 5’ P降解，有些生物的 mRNA 5’ P端被修飾保護(hù)，而不易降解。 ? 識(shí)別 tRNA的空間結(jié)構(gòu)，無種屬特異性 （ 4） RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 修飾酶，使得 RNA分子出現(xiàn)稀有堿基。 (2) 真核 tRNA基因比原核 tRNA基因多得多； (3) 5’端全有單磷酸核苷酸，表明已被加工過； (4) tRNA的前體分子中含有內(nèi)含子。 1 剪切位點(diǎn) 5 ’ 3 ’ 1 8 S 5 . 8 S 2 8 S 人類 H e L a 細(xì)胞途徑： 小鼠 L 細(xì)胞途徑： 4 5 S 4 1 S 4 1 S 3 2 S 3 6 S 2 0 S 1 8 S 1 8 S 3 2 S 2 8 S － 5 . 8 S 2 8 S － 5 . 8 SHela（人類）細(xì)胞和 L（鼠）細(xì)胞中 rRNA的加工途徑 ? rRNA前體的加工有多種途徑。 （ 2） RNAaseD： 外切核酸酶，使 Ⅰ 型 tRNA露出 CCA端 ? RNAaseP 存在時(shí) RNAaseD可達(dá)最大活性， ? RNAaseQ、 RNAaseY、 RNAaseP3與此酶功能相同。 5 RNA合成與 DNA合成異同點(diǎn) 相同點(diǎn)： 1）都以 DNA鏈作為模板 2） 合成的方向均為 5’ →3’ 3）聚合反應(yīng)均是通過核苷酸之間形成的 3’ ,5’ 磷酸 二酯鍵，使核苷酸鏈延長。 （ 2） 轉(zhuǎn)錄終止 ? 說明： AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要作用。