【正文】 RNA為 fMettRNAfMet 起始氨基酰 tRNA為 MettRNAiMet 核蛋白體小亞基先與 mRNA結(jié)合 ,再與fMettRNAfMet結(jié)合 核蛋白體小亞基先與 MettRNAiMet結(jié)合，再與 mRNA結(jié)合 mRNA中的 SD序列與 16S rRNA 3?端的一段序列結(jié)合 mRNA中的帽子結(jié)構(gòu)與帽子結(jié)合蛋白復(fù)合物結(jié)合 有 3種 IF參與起始復(fù)合物的形成 有至少 10種 eIF參與起始復(fù)合物的形成 延長階段 延長因子為 EFTu、 EFTs和 EFG 延長因子為 eEF1α、 eEF1βγ和 eEF2 終止階段 釋放因子為 RF RF2和 RF3 釋放因子為 eRF 蛋白質(zhì)合成的特點 的蛋白質(zhì)合成與 mRNA的轉(zhuǎn)錄分開進(jìn)行 原核生物 的蛋白質(zhì)合成與 mRNA的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)在一起同時進(jìn)行 中的 mRNA為單順反子 原核生物 中的 mRNA為多順反子 合成體系中的 RNA和蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與原核生物不同，且其線粒體有獨立的蛋白質(zhì)生物合成體系 阻遏蛋白介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控和 cAMPCAP介導(dǎo)的正調(diào)控共同擔(dān)負(fù)著原核生物體內(nèi)糖源的協(xié)調(diào)利用 翻譯水平的調(diào)控是對原核生物轉(zhuǎn)錄水平的補(bǔ)充 提高了基因表達(dá)調(diào)控的有效性 影響翻譯起始速率 mRNA的結(jié)合實現(xiàn)翻譯起始的調(diào)控 影響翻譯的延伸速度 基因表達(dá)調(diào)控的影響因素 —— 原核生物 （ 一） 真核生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu) 影響基因轉(zhuǎn)錄 超螺旋構(gòu)象 （二） 順式作用原件 （啟動子、增強(qiáng)子和沉默子）直接影響基因表達(dá)活性 （三） 轉(zhuǎn)錄因子 的調(diào)控 （四）真核生物在轉(zhuǎn)錄后仍可控制 mRNA的結(jié)構(gòu)和功能，其在 轉(zhuǎn)錄后層次 不同于原核生物 基因表達(dá)調(diào)控的影響因素 —— 真核生物 目標(biāo)蛋白性質(zhì) 是否需要糖基化 三維結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度 簡單結(jié)構(gòu) 復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu) 原核表達(dá)系統(tǒng) 真核表達(dá)系統(tǒng) 是 否 二、基因表達(dá)基本類型 原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌系統(tǒng)，芽孢桿菌系統(tǒng)等 產(chǎn)物溶解情況 表達(dá)位置 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)狀態(tài) 轉(zhuǎn)基因動植物 酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞等 包涵體 可溶性 胞內(nèi) 定位表達(dá) 分泌表達(dá) 非融合表達(dá) 融合表達(dá) 第二節(jié)外源基因表達(dá)基本過程 ? 將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，使該基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá) ? 【 四個要素 】 ? 工具酶、載體、基因和受體（宿主）細(xì)胞 基因工程的基本過程 1. 目的基因的獲取 ：從生物體中分離或人工合成 2. 重組載體的構(gòu)建 ：對目的基因和載體 DNA進(jìn)行剪切、修飾，在連接酶的作用下連接形成完整有復(fù)制能力的重組體 3. 重組 DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞 ：重組 DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增 基因工程的基本過程 4. 重組體的篩選與鑒定 ：直接篩選法 (如抗藥標(biāo)志選擇 )和免疫學(xué)方法 5. 目的基因的表達(dá)及分離純化 ：原核與真核表達(dá) 一、目的基因的獲得 ? 外源基因表達(dá)的第一步是獲得目的基因 ? 獲得目的基因的主要方法包括： ①化學(xué)合成 ② RTPCR從含有目的基因的總 RNA或mRNA中擴(kuò)增 ③從 cDNA文庫或基因組文庫中 PCR擴(kuò)增 ④通過雜交技術(shù)篩選 ⑤利用合適的篩淘技術(shù)從各種文庫中篩選 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) PCR（ polymerase chain reaction） : 在體外由引物介導(dǎo)的、酶促快速合成擴(kuò)增特定基因或 DNA片段的一種方法。 ? 表達(dá)載體是目的基因在宿主細(xì)胞中遺傳、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及可能的翻譯后修飾加工的保障。所以一般克隆的片段在 1kb之內(nèi)，克隆 300400bp的片段十分穩(wěn)定。羥基末端磷酸化、或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3’羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 基因工程相關(guān)酶學(xué) 限制性核酸內(nèi)切酶 具有識別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶 Ⅰ 型：修飾酶活性和依賴于 ATP的限制性內(nèi)切酶活性 Ⅱ 型： 內(nèi)切酶活性和修飾酶活性，專一性強(qiáng)。OH末端 ⑤ 催化 DNA合成的方向是 539。 要求外來的基因在宿主細(xì)胞中能夠準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)錄和翻譯，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中不被分解，而且最好還能分泌到細(xì)胞外。 制約目的基因表達(dá)的因素 一、制約目的基因表達(dá)的因素 二、閱讀框架 三、啟動子的影響 四、終止子的影響 五、翻譯過程對表達(dá)的影響 閱讀框架是由每三個核苷酸為一組聯(lián)接起來的編碼序列。市售的同一酶切點的人工接頭一般都有三種長度，經(jīng)與 DNA片段連接，并切割成黏性末端后，各相差一個核苷酸。 2) 將外源基因插入到載體的結(jié)構(gòu)基因中的適當(dāng)位置上，轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)果將產(chǎn)生一個融合蛋白。將這些不同的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，發(fā)現(xiàn)cro蛋白質(zhì)的水平在重組質(zhì)粒間相差懸殊，最高值比最低值大 2022倍。 在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中，通常使用的可調(diào)控的強(qiáng)啟動子有 lac(乳糖啟動子 )、 trp(色氨酸啟動子 )、 PL和 PR(λ 噬菌體的左向和右向啟動子 )以及 tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子 )等。 所以，在基因內(nèi)部的適當(dāng)位置上存在著轉(zhuǎn)錄的終止區(qū)，就能夠保證使質(zhì)粒的拷貝數(shù)（也就是基因的表達(dá)效率）控制在一個正常的水平上。 連接在 SD序列后面的 4個堿基成分的改變也會對轉(zhuǎn)譯效率發(fā)生很大的影響。 4)翻譯的起始包括活化的 30S核糖體亞基和 mRNA5’末端區(qū)域間的互作，這時 mRNA的 5’末端已折疊成特殊的二級結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)水平的改變是 mRNA二級結(jié)構(gòu)的反映。 5) 基因末端的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的影響。 ? 生物合成人胰島素 ：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。 長效 （魚精蛋白鋅胰島素）：注射后 46小時起效，高峰濃度 420小時，持續(xù) 2436小時。含有較多的胰島素原、胰多肽、生長激素、胰蛋白酶等雜質(zhì)，因而具有致敏性與抗原性，久用后可引起過敏反應(yīng)，胰島素抗體等。 人胰島素：不論半合成人胰島素或生物合成胰島素，其結(jié)構(gòu)、功能與人體內(nèi)生胰島素完全一致。 ? 達(dá)峰快，注射后 15分鐘起效， 30～ 60分鐘達(dá)到藥效高峰。 ） 是第一個用于臨床的速效胰島素類似物 ,由美國禮來公司研制生產(chǎn)，將人胰島素的 B28與 B29位的氨基酸對換。 APIDRA （賴谷胰島素， Apidra 174。 前肽序列引導(dǎo)目的蛋白通過正確的分泌途徑至胞外。但至 1985年，共發(fā)現(xiàn) 50多例克 雅氏癥， 5人病亡，研究結(jié)果證實由垂體來源的生長激素污染有朊病毒。 ? 人生長激素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) ? 重組人生長激素工程菌的構(gòu)建