基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)-預(yù)覽頁
【正文】 因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。 ?基因工程主要目標(biāo)之一是生產(chǎn)常規(guī)方法難以生產(chǎn)的大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物 — 即實現(xiàn)基因的高效表達(dá)。 ⑶ 生物活性高 。 一、真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系 目前，已被用于表達(dá)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細(xì)胞等。 2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄信號同原核的不同。 6. 大腸桿菌周質(zhì)內(nèi)存在各種內(nèi)毒素。 具有核糖體結(jié)合位點； 具有強(qiáng)啟動子； …… 二、大腸桿菌的表達(dá)載體 大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分 TTGACA。使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件。 此外，轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng) mRNA分子的穩(wěn)定性，從而大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。 （ 4）翻譯增強(qiáng)子 大腸桿菌和噬菌體基因中存在一些特殊的序列元件，能夠顯著地增強(qiáng)異源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率。 （ 5）翻譯終止密碼 對 mRNA翻譯終止而言，一個必不可少的條件是必須存在終止密碼子。 最常用的： ?噬菌體的 PL啟動子，大腸桿菌的 Lac啟動子、 Trp啟動子，以及 pBR322質(zhì)粒的 ?內(nèi)酰胺酶啟動子等一批強(qiáng)啟動子構(gòu)成的。它的特點是在感受態(tài)細(xì)胞的誘導(dǎo)方面，除了用 CaCl2和 MnCl2等二價離子按一定形式組合方式處理細(xì)胞外，還利用二甲亞砜（ DMSO）、二硫蘇糖醇（ DTT）和氯化六氨合高鈷等進(jìn)一步處理細(xì)胞，其它方面與上法相同。 電轉(zhuǎn)化法 電轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率受電場強(qiáng)度、電脈沖的時間和 DNA濃度等參數(shù)的影響。 ? 制備用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞相對容易。 四、克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá) 外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位 * 克隆在大腸桿菌細(xì)胞中的外源基因的表達(dá)部位： 細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞周質(zhì)；分泌到細(xì)胞外 這三種表達(dá)部位各有不同的優(yōu)缺點，而且對表達(dá)量和表達(dá)產(chǎn)物的制備有很大關(guān)系。 * 使克隆基因表達(dá)的外源蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)基中，是獲得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的最佳途徑。 已知有許多因素，如 不完全多肽 、 氨基酸取代突變 、多酶復(fù)合體亞基的超量合成 、 氧化作用或游離自由基的作用而造成的翻譯后損傷 ， 以及 基因工程技術(shù)的效應(yīng)等，都可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子受損或構(gòu)型變化，形成異常蛋白質(zhì)。 其中最重要的： N端氨基酸性質(zhì)。 重組操作時， N端增加一個增加穩(wěn)定性的氨基酸 （ 3）表達(dá)天然的蛋白質(zhì) 以形成融合蛋白的形式在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)外源真核基因具有許多方面的優(yōu)越性。 通過分子伴侶與克隆的外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中共表達(dá)是增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性、實現(xiàn)高水平表達(dá)的有效方法。 五、影響克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)效率的因素 啟動子的強(qiáng)度、 DNA轉(zhuǎn)錄起始序列、密碼子的選擇、 mRNA分子的二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性和寄主細(xì)胞生理特征 等都會不同程度地影響克隆基因的表達(dá)效率。 （ 2）啟動子與克隆基因的間隔距離對表達(dá)效率的影響 Roberts等用 ? DNA的含有 lac啟動子和SD序列與 ?cro基因表達(dá)序列構(gòu)建了不同間隔距離的重組質(zhì)粒載體。數(shù)字表示相對于 pTR161的蛋白質(zhì)合成數(shù)量。 增加 mRNA分子數(shù)量的因素有兩種： 1）啟動子強(qiáng)度； 2）基因的拷貝數(shù)，即基因劑量；最簡易的方法是將基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上。 RNAI是由 ColE質(zhì)粒 DNA編碼的長度為 108 nt的不翻譯 RNA分子，它通過干擾 RNAII的加工來抑制質(zhì)粒的復(fù)制。 天然質(zhì)粒都可以穩(wěn)定地保持在寄主細(xì)胞內(nèi)，這是由于它們具有一段 分配功能區(qū) Par所致。然后用一種啟動子缺陷的 ?突變體感染攜帶這種重組體質(zhì)粒的大腸桿菌寄主細(xì)胞，使之成為溶源性細(xì)菌。 ※ 已經(jīng)鑒定出 SD序列與 16S rRNA分子之間的堿基互補(bǔ)程度，可明顯地影響 mRNA的翻譯速率。 ※ 直接位于起始密碼 AUG上游的三個堿基的三聯(lián)體組成，同樣也對翻譯效率發(fā)生影響。 在不同種類的細(xì)菌中，這些核糖核酸酶的含量比例不同。 無論真核基因還是原核基因，一種特定的氨基酸并不是以同等頻率使用所有的同義密碼子，而主要使用其中的某一兩種。對于具高表達(dá)活性的基因，如果密碼子的頭兩個堿基是 AA或 UU，則其第三位堿基偏向選用 C，而如果頭兩個堿基是 GG或 CC，則其第三個堿基偏向選用 U。 寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)對基因表達(dá)的影響 大腸桿菌的生理狀態(tài)會或多或少地影響外源基因的表達(dá)效率；但究竟是怎樣影響外源基因的表達(dá)效率，仍缺乏全面系統(tǒng)
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