基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(文件)
【正文】 蛋白質(zhì)折疊了可能無法恢復(fù)起生物學(xué)活性 （ 1）蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離 還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成 （ 2）蛋白質(zhì)受保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解 （ 3）蛋白質(zhì)沒有活性，不會(huì)使細(xì)胞受傷害 表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單 周質(zhì) 周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類較少，純化簡(jiǎn)單 信號(hào)肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白質(zhì)酶解程度不嚴(yán)重 有可能形成包涵體 促進(jìn)二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊 蛋白質(zhì) N末端結(jié)構(gòu)真實(shí) 胞外 蛋白質(zhì)的酶解作用程度很底 在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白通 目標(biāo)蛋白的純化容易，由于分泌到胞外的 常不會(huì)分泌到胞外 蛋白種類少 由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)相當(dāng)于稀釋，因 增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用 此目標(biāo)蛋白的得率較低 蛋白質(zhì) N末端結(jié)構(gòu)真實(shí) * Talmadge和 Gilbert（ 1982）將外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的不同部位表達(dá)。 外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的穩(wěn)定性 當(dāng)一種克隆的外源基因在大腸桿菌中不能實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)時(shí)，我們往往會(huì)認(rèn)為這是由于轉(zhuǎn)錄或翻譯過程發(fā)生了問題。 為了避免在大腸桿菌中發(fā)生外源蛋白質(zhì)的降解，或?qū)⒋私到庾饔每刂圃谧畹退剑厌槍?duì)性發(fā)展出了許多種不同的技術(shù)方案。 N端氨基酸性質(zhì) “N端法則” : 在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)新陳代謝的穩(wěn)定性，主要取決于 N端氨基酸的性質(zhì)。例如，產(chǎn)物比較穩(wěn)定，可以免受胞內(nèi)蛋白酶的降解作用，可以獲得較高的產(chǎn)率。 （ 5）大腸桿菌突變體菌株與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 通過產(chǎn)生融合蛋白途徑增加外源多肽穩(wěn)定性的方法，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，但此法的一個(gè)突出缺點(diǎn)是所產(chǎn)生的融合蛋白并不一定都能夠在體外將天然蛋白質(zhì)完整無損地切割下來。 啟動(dòng)子對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響 (1) 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響 大腸桿菌啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)保守序列，即 35區(qū)（ 5’TTGACA）和 10區(qū)（ 5’TATAAT），后者又叫 Pribnow盒。從中挑選了 9種不同的重組質(zhì)粒載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，然后測(cè)定各種克隆所產(chǎn)生的 cro蛋白質(zhì)含量，同時(shí)也對(duì)每種質(zhì)粒中的連接 laccro基因的結(jié)合區(qū)序列進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果表明： 攜帶不同重組體質(zhì)粒的菌株所合成的 cro蛋白質(zhì)數(shù)量，是同 laccro基因的結(jié)合區(qū)序列相關(guān)聯(lián)，但這種相關(guān)性并沒有一定的規(guī)律； 但 5’端與 SD序列之間的距離應(yīng) ?15bp。 質(zhì)粒的拷貝數(shù)受質(zhì)粒復(fù)制控制區(qū)和宿主菌的遺傳背景影響。 Rom蛋白是由 ColE質(zhì)粒 rom基因編碼的一種反式作用抑制劑，它可形成二聚體增強(qiáng) RNAI和RNAII之間的堿基配對(duì)，從而抑制引物的形成。分配功能區(qū) Par能夠保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中都能準(zhǔn)確地分離，并均勻地分配到子細(xì)胞中去。在這種溶源性細(xì)菌中，重組質(zhì)粒的喪失，伴隨著發(fā)生 ?阻遏物的喪失，則原噬菌體便被誘發(fā)進(jìn)入溶菌生長周期，從而使寄主細(xì)胞裂解死亡。當(dāng)此序列為 5’GGAGG3’時(shí)，可與 16S rRNA 3’端區(qū)段完全互補(bǔ)，翻譯效率最高；而當(dāng)該序列發(fā)生單堿基突變時(shí)，翻譯效率便下降 30倍之多。 以 ?半乳糖苷酶 mRNA的翻譯為例，當(dāng)這三聯(lián)體組分為 UAU或CUU時(shí)，翻譯效率最高；而如果是 U
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