【正文】 母克隆表達質(zhì)粒的構(gòu)建 酵母的轉(zhuǎn)化程序 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運 用于酵母轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng) D 6 外源基因在酵母中的表達 酵母的轉(zhuǎn)化程序 酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 在 Ca2+和 PEG的存在下 ， 轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達原生質(zhì)體總數(shù)的 12%。 酵母的轉(zhuǎn)化程序 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運 單雙鏈 DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌，但 單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的 1030倍 ； 含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進入細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制； 不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進入細(xì)胞后 ， 能高效地 同源整合 入染色體 這對于體內(nèi)定點突變酵母基因組極為有利； 克隆在 YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因 ， 如果含有受體細(xì)胞的染色體 DNA的同源序列 ， 會發(fā)生高頻同源整合 ， 整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的 5080%。 酵母啟動子的可控性 外源基因在酵母中表達的限制因素 酵母表達系統(tǒng)的選擇 酵母的表達系統(tǒng) E 6 外源基因在酵母中的表達 酵母啟動子的可控性 溫度控制型啟動子 pho4TSPHO5啟動子： 釀酒酵母 PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開； PHO4基因編碼產(chǎn)物是 PHO5啟動子的正調(diào)控因子； 因此，裝在 pho4TSPHO5啟動子下游的外源基因在 35℃ 時關(guān)閉， 23℃ 誘導(dǎo) 表達。 釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其 超糖基化 能力，往往使得 有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能 大量分泌。 酵母表達系統(tǒng)的選擇 巴斯德畢赤酵母是一種 甲基營養(yǎng)菌 ， 能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 長 ， 甲醇 可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達 。 的高效表達在一定程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡 。 得成功表達。 病毒顆粒的主要結(jié) 構(gòu)蛋白是病毒的 表面抗原 多肽 （ HBsAg） 或 S多肽 ， 它具有糖基化和 非糖基化兩種形式 。 乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因 ATG ATG ATG TAA 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S S 多肽 226 aa M 多肽 281 aa L 多肽 399 aa 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫 傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備 苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來的。 進一步的研究表明 ， M多肽和 L多肽對 S型疫苗具有顯著的增效作 用 ， 由三者 （ 或兩者 ） 構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對 S 抗 原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。 由于不少藥用糖蛋白需要唾液酸化 ，因此其生產(chǎn)目前只能依靠哺乳動物受體 ， 因為后者能進行人樣化的 N糖基化 反應(yīng) ， 包括在末端加唾液酸的能力 。 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 敲除 4個基因，摧毀 巴斯德畢赤酵母原有的超糖基化系統(tǒng)： Doch1， Dpno1， Dmnn4B， Dbmt2 導(dǎo)入 9個基因，構(gòu)建 人的糖基化系統(tǒng)： UgnT：小鼠的 UDPN乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運蛋白 UgnT：克魯維酵母的 UDPN乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運蛋白 MnsI：小鼠的 a1,2甘露糖苷酶 I MnsII：果蠅的 a1,2甘露糖苷酶 II GnTI：人的 b1,2N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 I GnTII：大鼠的 b1,2N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 II GalE：裂殖酵母的 半乳糖差向異構(gòu)酶 GalE：果蠅的 UDP半乳糖轉(zhuǎn)運蛋白 GalT： 人的 b1,4半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶 YSH577 rEPO 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 YSH577 rEPO JC308 WT RDP750 b1,NGlcNAc b1,4GlcNAc b1,2GlcNAc b1,4Man a1,6Man a1,3Man a1,2Man b1,4Gal 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 YSH577 rEPO 再導(dǎo)入 5個基因，構(gòu)建 末端唾液酸的添加系統(tǒng)： GNE：人的 UDPN乙酰葡糖胺 2差向異構(gòu)酶 / SPS：人的 N乙酰甘露糖胺丙酮酸 9磷酸合成酶 CSS：人的 CMP唾液酸合成酶 CST：小鼠的 CMP唾液酸運輸因子 ST： 人的 唾液酸轉(zhuǎn)移酶與酵母 II型轉(zhuǎn)膜定位肽 遺憾的是， YSH577株并未像預(yù)期的那樣在糖基末端有效添加 唾液酸。 長期以來 ， 人們普遍關(guān)注的是對乙醇生物合成基因和耐受基因的遺傳操作 ， 這些努力雖然取得了顯著的進步 ， 但似乎觸及了極限 。 有證據(jù)顯示 ， TATABOX結(jié)合蛋白的突變會改變 RNA聚合酶對啟動子的特異性識別性質(zhì) ， 進而影響眾多不同基因的表達譜 。 當(dāng)篩選壓力增加到 6%的乙 醇和 120g/L的葡萄糖時 ， 獲得 spt15300突變株 ， 它相對野生株的耐受倍數(shù)達 13倍 。 spt15300突變株的鑒定 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2022 具有優(yōu)良特性的 spt15300突變株包含三個突變位點 ， 它們均集中在TBP的重復(fù)序列 2結(jié)構(gòu)域