[農(nóng)學(xué)]基因工程-第三章-基因工程的載體-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 葉亞新 分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性 1. 影響轉(zhuǎn)化頻率的因素 1) 復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點(diǎn) 2) 標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達(dá)的標(biāo)記基因 2. 影響穩(wěn)定性的因素 1) 復(fù)制起點(diǎn)類(lèi)型 —低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差 2) 選擇壓力 3) 載體在宿主細(xì)胞中的狀態(tài) —自主復(fù)制型和整合型 宿主細(xì)胞的遺傳特性和生理特性 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 定義 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈 DNA分子（ Covalently closed Circular DNA, ccc DNA） 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 自主復(fù)制性 ? 質(zhì)粒 DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ ori）以及一個(gè)控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因，因此它能獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體 DNA而自主復(fù)制 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 不相容性 ? 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（ RNAI RNAII Rop因子）如果被導(dǎo)入同一細(xì)胞中，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中，就會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng) ，幾種質(zhì)粒中只能有一種長(zhǎng)期穩(wěn)定地留在細(xì)胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 1. 多拷貝質(zhì)粒 經(jīng)過(guò)人工突變，除去控制拷貝數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pUC系列質(zhì)粒 ? pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn) ? 更小的相對(duì)分子量和更高的拷貝數(shù) ? 可用組織化學(xué)法檢測(cè)重組體 ? 具有多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段 是基因工程中目前最常用的 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)粒（ plasmid）的制備 1. 堿裂解法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA的緩沖液體中 （ 2）加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 （ 3）加 NaOH與 SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 （ 4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體 DNA及大部分蛋白質(zhì) （ 5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶 （ 6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 （ 7）無(wú) DNase的 RNase處理殘余 RNA 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)粒（ plasmid）的制備 2. 沸水浴法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA和 Triton X100的緩沖液中 （ 2）加溶菌酶破細(xì)胞壁 （ 3）放入沸水浴中煮 40秒 （ 4）離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物 （ 5）乙醇異丙醇沉淀 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 一、 Ti質(zhì)粒載體 1. 根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)與 Ti質(zhì)粒 G菌，可侵入 90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤 (crown gall tumor)。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 YAC:酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome） 目前能容納最大外源 DNA片斷的載體 . ? YAC載體有兩個(gè)臂，每個(gè)臂的末端有一個(gè)端粒（ TEL），臂上有著絲粒（ CEN）、自主復(fù)制序列（ ARS）、選擇標(biāo)記（ TRP1和 URA3） ? 裝載容量： 50Kb2021Kb ? YAC載體是以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)，如： pYAC2 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 一、 l噬菌體的分子生物學(xué) ? l噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和l DNA組成 ? 1. lDNA的物理圖譜 ? lDNA為線狀雙鏈 DNA分子，兩端各有一個(gè) 12核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘性末端），稱為 cos區(qū)，全長(zhǎng)。其允許插入片段最大為 。 阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散 ，而基因工程實(shí)驗(yàn)中用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。由于 lDNA包裝時(shí)，其包裝蛋白只識(shí)別粘性末端附近的一小段順序，均 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 采用 Cosmid作載體的困難 ① 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的 1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。 單鏈 DNA利用宿主細(xì)胞的復(fù)制另一條鏈（負(fù)鏈），形成 dsDNA（ RFDNA） ，故 M13能以 dsDNA的形式從細(xì)胞中分離作為克隆載體 ? 宿主細(xì)胞不會(huì)發(fā)生裂解 。 所以如果要同時(shí)分離ＤＮＡ分子中的雙鏈 ， 則需要兩種獨(dú)立的克隆 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第五節(jié) 其他載體 一、 BAC：細(xì)菌人工染色體（ bacterial artificial chromosome） 基于 F因子建立起來(lái)的單拷貝 ，裝載容量 300Kb，穩(wěn)定性較好，用于克隆大片端 DNA，從而構(gòu)建整個(gè)人類(lèi)基因組文庫(kù) 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 BAC載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核 DNA重組需要。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自 猴腎病毒 SV40（ Simian Virus 40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等。當(dāng)外源 DNA插入該載體后，與相應(yīng)的天然病毒一起感染動(dòng)物細(xì)胞，外源 DNA可借助兩病毒 DNA同源部分的重組插入天然病毒。 3. 實(shí)例 1) SV40質(zhì)粒載體 SV40具如下物理圖譜， 5243bp, 為兩種抗原（ T和 t抗原）和三種病毒衣殼蛋白編碼。
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