【正文】 ⑷ NH4Cl： NaCl: 冰塊 （ 20:40:100） ， 最低冷凍溫度為 30℃ ； ⑸ 氯仿 +固體 CO2， 最低冷凍溫度為 77℃ ⑹ 酒精 +固體 CO2， 最低冷凍溫度為 72℃ 冷凍樣品測(cè)定時(shí) ， 要求解凍后樣品一次性測(cè)定完畢 。 （ 五 ） 樣品的預(yù)處理及測(cè)定 樣品的處理：體液中的藥物由于體液中雜質(zhì)的干擾通常不能用儀器直接進(jìn)行測(cè)定。 因此，在定量測(cè)定前，要對(duì)生物體液或組織中的待測(cè)成分進(jìn)行分離和富集來(lái)提高分析測(cè)定的靈敏度。 在定量分析中常用的分離方法包括：根據(jù)分子大小與幾何形狀或電荷進(jìn)行分離的分子篩、凝膠滲透色譜、氣體擴(kuò)散，膜滲析、電泳等分析；根據(jù)表面活性進(jìn)行分離的吸附色譜，高效液相色譜、活性碳吸附方法；根據(jù)藥物的揮發(fā)性進(jìn)行分離的蒸餾與揮發(fā)、升華、冷凍干燥，有機(jī)物灰化方法； 根據(jù)溶解度進(jìn)行分離的沉淀 、 共沉淀 、 選擇溶解方法；根據(jù)分配平衡進(jìn)行分離的溶劑萃取法 ， 固液萃取法 、 分配色譜法 、薄層色譜法以及根據(jù)離子交換平衡進(jìn)行測(cè)定的無(wú)機(jī)和有機(jī)離子交換法等 。 在分析測(cè)定時(shí) ， 回收率越高 ， 其分析方法結(jié)果的可靠性就越高 。主要注意如下幾方面的問題：選擇恰當(dāng)?shù)姆蛛x方法；選擇最佳的萃取溶劑；在低溫條件下萃取 （ 例如通氮?dú)獾?） ， 防止藥物的氧化分解；增加萃取的次數(shù)等 。 在血樣中加入有機(jī)溶劑 、 酸 、 鹽或重金屬離子可使血漿蛋白沉淀折出 。 沉淀蛋白質(zhì)的酸類為陰離子型沉淀劑 ， 常見的有三氯乙酸 、 高氯酸 、 鎢酸等 。 高氯酸沉淀蛋白質(zhì)時(shí) ， 其酸根可通過加入鉀鹽而消除；三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)時(shí) ， 再用乙醚萃取樣品中的藥物時(shí) ， 由于三氯乙酸可溶于萃取溶劑乙醚中 ， 而干擾測(cè)定結(jié)果 。 在血液蛋白質(zhì)膠體溶液中 ， 也會(huì)使水的介電常數(shù)減小 ， 改變蛋白質(zhì)的電荷數(shù)而破壞水化膜 ， 增加蛋白質(zhì)顆粒靜電引力 ， 使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀 。 有時(shí)為了提高血樣與尿樣中藥物分離萃取的效率，需要將血樣中呈現(xiàn)結(jié)合狀態(tài)的藥物水解出來(lái)。 常用的方法有酸水解法 （ HCl） ， 酶水解法 （ β 葡萄糖醛酸甙酶 ， 芳香基硫酸酯酶 ） 和溶劑解三種 。 ① 分配系數(shù) 液 — 液萃取也叫溶劑萃取。 ]/[][ 水非 AAk d ?② 分配比 在液 — 液萃取過程中 ， 藥物在水相和非水相中常以多種形式存在 ， 如離解態(tài) ， 聚合態(tài) ， 絡(luò)合態(tài)或與其他組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等等 。 水非水水水非非非][][][][][][][][2121CCAAAAAADnn ?????????? 值得說(shuō)明的是只有當(dāng)藥物在兩相中的存在形式完全相同時(shí) ，分配比 D才等于分配系數(shù) kd。 在實(shí)際工作中 ， 如果 D值不充分大時(shí) ， 應(yīng)該分次加入有機(jī)溶劑進(jìn)行多次連續(xù)萃取 ， 以提高其萃取分離的效率 。根據(jù)這一特點(diǎn)，可使用酸或堿使藥物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的鹽而溶于極性溶劑水中，再調(diào)節(jié)樣品的 pH值，使離子型藥物轉(zhuǎn)變成非電離型（分子型）而溶于非極性溶劑中。 例如苯巴比妥的 pKa值為 。 值得注意的是上述這一規(guī)則對(duì)于高度電離的極性化合物 ，如季銨鹽類 （ 氨基甙類抗生素 ） 或具有兩性化合物性質(zhì)的藥物（ 四環(huán)素類藥物 ， 磺胺類藥物 ， 氟喹諾酮類藥物 ） 以及有形成兩性離子傾向的化合物并不適合 。 酸性藥物萃取的 pH值應(yīng)低于其 pKa值 23個(gè)單位 。 液 — 液萃取常用的有機(jī)溶劑見表 112。 選擇有機(jī)相的基本原則是： 滿足萃取的需要 ， 盡可能提高其萃取率 ， 即選擇對(duì)被提取物有較大親合力 ， 與水互不相溶的有機(jī)溶劑 。 加入無(wú)機(jī)鹽還能減少藥物在有機(jī)溶劑與水相間提取時(shí)發(fā)生乳化 ， 有利于提取的操作 。 洗滌：在液 — 液萃取過程中 ， 血液中的干擾組分也可能進(jìn)入有機(jī)相中 ， 當(dāng)干擾組分的分配比較小時(shí) ， 可用洗滌的方法除去 。 ⑥ 液 — 液萃取問題及處理方法 在萃取過程中 ， 萃取液靜置分層時(shí) ， 在兩相交界處有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一層乳濁液 ， 有時(shí)整個(gè)兩相液體全部發(fā)生乳化 ， 造成水相與有機(jī)相分離不全或完全不能分離 ， 此時(shí)可采用下列方法進(jìn)行處理： 增大有機(jī)溶劑用量； 萃取前在水相中加入適量電解質(zhì)如氯化鈉 ， 減輕乳化程度； 改變?nèi)芤旱?pH值 ， 避免在過高 pH值條件下從水相中提取藥物； 避免使用容易發(fā)生乳化的溶劑對(duì) ， 如水與已烷 ， 水與苯 ， 選用具有高的界面張力和密度差異大的溶劑 。 也可用含 10%的二甲基二氯硅烷的甲苯溶液充滿干燥玻璃試管 ， 放置 30分鐘傾出 ， 依次用甲苯 、 甲醇淌洗 ，然后烘干備用 。然而，隨尿排出的嗎啡，只有 15%游離的， 85%是與葡萄糖醛酸結(jié)合成酯。 使嗎啡游離出來(lái) 。 再用氣相色譜法測(cè)定其含量 。 體液中藥物定量分析 常見的分析方法有光譜法 、 免疫分析法 、 色譜法 、 手性色譜法 、 毛細(xì)管電泳法以及儀器分析聯(lián)用技術(shù) 。 包括檢測(cè)限 、定量限和最低檢測(cè)濃度 。 最小檢測(cè)濃度等于定量限除以進(jìn)樣體積 。 在進(jìn)行生物利用度和生物等效性研究時(shí) ， 要求定量限至少能滿足測(cè)定 3～ 5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度 ， 或最大血藥濃度的 1/10～ 1/20時(shí)的藥物濃度 。 藥物動(dòng)力學(xué)研究試驗(yàn)總是以隨機(jī) 、 對(duì)照和重復(fù)的原則來(lái)保證樣本的代表性 ， 提高血藥濃度測(cè)定的準(zhǔn)確度和精確度 ， 確定正確實(shí)驗(yàn)方法 ， 降低試驗(yàn)的隨機(jī)誤差， 以便進(jìn)行相應(yīng)最有效的統(tǒng)計(jì)整理分析 ， 得出科學(xué)的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)論 。 如在進(jìn)行化療藥物在水產(chǎn)動(dòng)物魚體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)時(shí)，由于動(dòng)物的體重小，采血量就受到一定限制。 即先取得血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)的平均值 ，再以平均值來(lái)估測(cè)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) ， 其所需樣本含量必須增加 。 （ 二 ） 藥物動(dòng)力學(xué)研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法 在動(dòng)物試驗(yàn)中常見的設(shè)計(jì)方法有完全隨機(jī)設(shè)計(jì) （Completely randomized design） ， 配對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì) （Paired design） ， 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì) （ Randomized block design） ， 拉丁方設(shè)計(jì) （ Latin square design） ， 交叉設(shè)計(jì) （ Crossover design） 和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) （Orthogonal design） 。利用兩次不同處理后的藥時(shí)曲線下面積之比估測(cè)其絕對(duì)生物利用。這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)最顯著的特點(diǎn)是可以減少或消除動(dòng)物個(gè)體差異及試驗(yàn)時(shí)間所引起的差異，使用較少的試驗(yàn)動(dòng)物，獲得較高的精確度。 現(xiàn)要測(cè)定其口服其片劑后的絕對(duì)生物利用度 。 表 119 絕對(duì)生物利用度 2 2交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)表 ....viopAUCAUCF ?動(dòng)物編號(hào) 第一次處理 第二次處理 1 靜注 口服 F1 2 口服 靜注 F2 3 靜注 口服 F3 4 口服 靜注 F4 5 靜注 口服 F5 6 口服 靜注 F6 7 靜注 口服 F7 8 口服 靜注 F8 9 靜注 口服 F9 10 口服 靜注 F10 注： ； ； 。 （ 二 ） 誤差與錯(cuò)誤： 誤差按來(lái)源不同分為系統(tǒng)誤差 （ Systematic error） 和隨機(jī)誤差 （ Random error） 。 誤差是可以原諒的， 但錯(cuò)誤在科學(xué)研究中是不被原諒的 ， 兩者有本質(zhì)的區(qū)別 。 在科學(xué)研究中 ， 總是首先在保證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性 （ 正確性 ） 條件下再來(lái)提高研究結(jié)果的精確度 。 例如 ， 在用 HPLC法分析測(cè)定生物組織樣中的藥物時(shí) ， 為了求得其方法的萃取回收率 ， 先是將已知濃度的被測(cè)藥物加到空白組織樣中 ， 按規(guī)定的萃取方法處理 ， 最后定容使溶液中的藥物濃度與原來(lái)加到空白樣中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度一致 ， 進(jìn)樣測(cè)定其色譜峰面積為 Ac ， 另取與處理樣濃度一致的藥物標(biāo)準(zhǔn)品的純?nèi)軇┤芤褐苯舆M(jìn)樣 ， 測(cè)定其色譜峰為At ， 則用外標(biāo)法測(cè)定計(jì)算的萃取回收率為： 萃取回收率 （ ％ ） =Ac/At 100 求萃取回收率時(shí) ， 應(yīng)測(cè)定高 、 中 、 低 3個(gè)處理濃度 ， 低濃度應(yīng)確定在定量限 （ LOQ） 附近 ， 高濃度應(yīng)確定在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度上限附近 ， 在兩者之間再選一個(gè)濃度 。則用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定計(jì)算的萃取回收率為： 萃取回收率（％）＝ Rc /Rt 100 除了用外標(biāo)法測(cè)定外 ， 為了克服儀器的不穩(wěn)定性以及測(cè)樣時(shí)間的不一致性等所帶來(lái)的測(cè)定誤差 ， 可用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定藥物含量 。 變異系數(shù) 實(shí)際上 ， 標(biāo)準(zhǔn)差是表示一組變數(shù)變異程度的絕對(duì)變異量 ，只有當(dāng)兩樣本單位與平均數(shù)相同時(shí) ， 才能用標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)兩組變數(shù)進(jìn)行比較 。高濃度選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線上限附近，低濃度選在定量限附近，中間選定一個(gè)濃度。 批間變異系數(shù)和批內(nèi)變異系數(shù) 變異系數(shù)是指一組變數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差與其變數(shù)個(gè)數(shù)的平方根之比值 。 在體液藥物定量分析時(shí) ， 一般要求其批間變異系數(shù)小于 10%， 批內(nèi)變異系數(shù)小于 5%。 （ 一 ） 藥物動(dòng)力學(xué)房室模型確定方法 在選擇或確定某藥物的房室數(shù)目時(shí) ， 其基本要求有兩點(diǎn) ， 一是使測(cè)定值能夠均勻地分布在所建立的血藥濃度一時(shí)間曲線附近；一是使血藥濃度實(shí)測(cè)值 Ci與按所選擇模型估算出來(lái)的理論值 之差的平方和 （ 殘差平方和 ） 值 達(dá)到最小 。 利用模型確定系數(shù) γ 2判斷法 γ 2值的定義如下： （ ） ??????????niininiiCCiCiC1212122)(?其中： γ 2為模型確定系數(shù)； Ci為實(shí)測(cè)血藥濃度； 為通過模型計(jì)算出的理論血藥濃度 。 ?????nii CiCR122 )(?iC 相關(guān)系數(shù)法 利用比較實(shí)測(cè)值與不同模型估算值的相關(guān)系數(shù)來(lái)判斷 。 其定義為： AIC=nlnRe+2p （ ） 其中 ， n是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)； p代表參數(shù)的數(shù)目； Re是權(quán)重殘差平方和 ， 其 Re可定義如下： （ ） 其中 ， Wi是權(quán)重系數(shù) ， 通常取實(shí)測(cè)值的倒數(shù)或取實(shí)測(cè)值平方的倒數(shù) 。 kt0 eCC ?tt BeAeC ?? ?? ??ttt PeBeAeC ??? ??? ??? F檢驗(yàn)判別法 構(gòu)造統(tǒng)計(jì)量 F （ ） )(R212122e2e1eeeRRdfdfdfRRF ????其中 Re1和 Re2分別表示兩種模型的加權(quán)殘差平方和 ， df表示自由度 ， 自由度定義為實(shí)驗(yàn)采血次數(shù) n與待定參數(shù)個(gè)數(shù) p之差 。 3 1 2 5 ????F（ 二 ） 藥物動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的計(jì)算 藥物動(dòng)力學(xué)模型的建立和參數(shù)計(jì)算需要進(jìn)行復(fù)雜的數(shù)理邏輯判斷和數(shù)學(xué)運(yùn)算 。 該計(jì)算軟件功能齊全 ， 采用文字和圖標(biāo)對(duì)話 ， 使用方便 。 MCPKP軟件可在 IBM及其兼容微機(jī)上運(yùn)行 。 張文貴等編寫的藥物動(dòng)力學(xué)計(jì)算的 BASIC語(yǔ)言程序 ：見張文貴、林福生、李北波。是一個(gè)較好的實(shí)用性強(qiáng)的計(jì)算機(jī)程序。 是國(guó)內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)計(jì)算最權(quán)威的程