《雙向凝膠電泳》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 條的形式和塑料支撐薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。 ? 重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，操作時(shí)需參照相關(guān)說明書。 其中窄范圍堿性 IPG膠 （ 如 pH1012) 的挑戰(zhàn)是克服反向 、 陰極向陽極 、 電滲流和水平條紋模式 ， 而寬范圍的堿性 IPG膠 （ 如 pH31 412) 等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液 。 ? 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。 圖像分析軟件： ? Amersham pharmcia Biotech公司： imageMasterTM 2D version: ? BIORAD公司： PDQuesTM 4. 雙向電泳分析中的樣品制備 ? 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 Amersham pharmcia Biotech公司 Ettan DALT II System： (1) 此系統(tǒng)的電源控制為 Power Supply/Control Unit：最大輸出功率是200W；溫度控制范圍是 1050℃ 最大電壓 600V；最大電流 1A。 BIORAD公司 PROTEAN IEF Cell 等電聚焦儀： Amersham pharmcia Biotech公司 IPGphor等電聚焦儀： 電極區(qū)域?yàn)殂~鍍金板 ； 最多上 12個(gè)樣品 ； 平臺(tái)溫度為 1825℃ 177。 ? 變性 2DPAGE：樣品先用 2%SDS + 5%β ME + 95℃ 變性 5min, IEF在 8M尿素 + 1%NP40條件下進(jìn)行，之后膠條用 2%SDS + 5%β ME平衡，然后進(jìn)行 SDSPAGE。 ? 非變性 2DPAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的； ? 非變性 /SDS2DPAGE：第一向采用非變性 IEF，之后在 2% SDS溶液中平衡；第二向也在 SDS存在的條件下進(jìn)行。 三種雙向凝膠等電聚焦系統(tǒng) 根據(jù)第一向等電聚焦條件和方式的不同，可將雙向凝膠電泳分為三種系統(tǒng)： ISODALT、 NEPHGE和 IPGDALT。目前常使用預(yù)制膠條 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG 膠條在含有 SDS 的緩沖液中平衡。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點(diǎn) pH 位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動(dòng)。 此項(xiàng) 技術(shù)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離并展示的分離技術(shù)，一般能分離 1000 – 3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，最好的膠能分離得到 11000個(gè)左右的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 隨后， Raymond發(fā)明了聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，雙向電泳的支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠 (Margolis J, Kenrick KG. Twodimensional resolution of plasma proteins by bination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 10561057)，這即是雙向凝膠電泳 (twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 生物學(xué)問題的提出 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點(diǎn)的切取 胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化 質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析 質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì) 新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證 蛋白信息的初步獲得 蛋 白 質(zhì) 組 分 析 流 程 蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線 蛋白質(zhì)樣品的制備 雙向電泳 圖像分析 轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白 凝膠中的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 蛋白質(zhì)質(zhì)量 N端測序 肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù) 肽指紋圖 數(shù)據(jù)搜索 新的或已知蛋白 蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定 2. 雙向電泳技術(shù)的發(fā)展及原理 ? 雙向凝膠電泳的發(fā)展 ? 雙向凝膠電泳的基本原理 雙向凝膠電泳的發(fā)展 雙向凝膠電泳的思路最早是由 Smithies 和 Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Twodimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白質(zhì)第一向電泳是根據(jù)其自由溶液遷移率 (freesolution mobility)，在濾紙條上進(jìn)行；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)行。 1975年， O’Farrell、 Klose和 Scheele分別對(duì)雙向凝膠電泳做進(jìn)一步的優(yōu)化，建立了高分辨率的雙向凝膠電泳 (O’Farrell PH. High resolution twodimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975
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