《雙向電泳技術(shù)》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 后的質(zhì)譜分析。 該技術(shù)適于 DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析 ， 或分析被碳?xì)滏I連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性 ， 但此方式顯示的大于 100Kd的蛋白質(zhì)點(diǎn)少于第三種方式 雙向電泳的分類 43 二、流程 （一）樣品制備 （二）第一向：等電聚焦 加樣 運(yùn)行 （三）膠條的平衡 （四）第二向： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （五）膠上蛋白的檢測 考馬斯亮藍(lán)染色 銀染 負(fù)染 熒光染色 44 （六）雙向電泳凝膠的檢測 目測 自動(dòng)化檢測 雙向電泳的數(shù)據(jù)庫 （七）雙向凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)： 低拷貝蛋白的檢測受限； 極酸或極堿蛋白的分離較難； 分子質(zhì)量極大或極小蛋白的分離較難； 難溶蛋白的檢測較困難； 得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù) 45 一維固相 pH梯度等電聚焦（ IEF with IPG）： ? IPG膠的材料是 Immobilines，為擁有CH2=CHCONHR結(jié)構(gòu)的 8種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在 pH3~10不同值的緩沖體系。 適于分析非共價(jià)鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用 。可得到天然蛋白質(zhì)的分子量。 30 固相 pH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán) 31 固相 pH梯度的優(yōu)點(diǎn)和注意事項(xiàng) 固相 pH梯度等電聚焦原理 蛋白質(zhì)分子按照自己的 pI位置在固相 pH梯度中遷移，知道達(dá)到自己的等電點(diǎn)，停止遷移。分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價(jià)鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中。 28 固相 pH梯度的介質(zhì) 其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，它們與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有相似的聚合行為。 ⑤ 蛋白質(zhì)在 pI處形成沉淀。 26 載體兩性電解質(zhì)分離原理 等電聚焦樣品可放于任何位置。這種方法形成的 pH梯度很不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不使用。 ③ 分子質(zhì)量小，便于與被分離的高分子物質(zhì)分離。 22 一、基本原理 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：取決于其氨基酸的組成。 ：需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。 等電聚焦： isoelectric focusing,IEF。 ?也會(huì)由于超聲、 γ 射線和自然光線引起聚合作用。 14 15 丙烯酰胺會(huì)產(chǎn)生如下幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)： ?高濃度酸和堿會(huì)促進(jìn)其水解形成丙烯酸和 NH3。 12 聚丙烯酰胺凝膠的聚合 13 催化劑和加速劑的種類 ① APTEMED：化學(xué)聚合作用。對(duì) pH和溫度變化較穩(wěn)定。 10 四、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ polyacrylamidegel electrophoresis，簡稱 PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。 ? 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。 ④ 瓊脂糖凝膠電泳 ：一般用于核酸的分離分析。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 區(qū)帶電泳 ：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。 由 F = Eq， f = 6π r υ η 可得 υ =Eq/(6π r η ) 帶電顆粒的泳動(dòng)速度同 電場強(qiáng)度 和分子本身所帶的 凈電荷量 成 正比 ，與 顆粒半徑 和 介質(zhì)黏度 成 反比 。 *1959年 Raymond和 Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。 他用不同 pH的溶液在 U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動(dòng)和等電點(diǎn)。 *1909年 Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動(dòng)稱為電泳。 *從上世紀(jì) 50年代起，特別是 1950年 Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。 3 一、電泳的基本原理 在電場作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（ electrophoresis)。 第一節(jié) 蛋白質(zhì)電泳的基本原理 4 在一定 pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷 (種類和數(shù)量 )、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶鲋杏緞?dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。 穩(wěn)態(tài)電泳 （或稱置換電泳）：分子顆粒的電泳遷移在一定時(shí)間達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)后，帶的寬度不隨時(shí)間而變化。 6 7 ??? 按 支持介質(zhì)種類 的不同，區(qū)帶電泳可分為 ① 紙電泳 ：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。其分辨率較高。 按 pH的連續(xù)性不同，可分為：連續(xù) pH電泳，不連續(xù) pH電泳。 ②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不
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