雙向凝膠電泳ppt課件-免費閱讀
【正文】 溴酚藍(lán)前沿兩邊上翹 冷凝不好，檢查冷凝器是否工作正常。 2DPAGE問題與原因 第一向等電聚焦的問題 問題與現(xiàn)象 可能原因與解決措施 IPG膠條在靠近電極附近燒焦 電流限制太高，最大電流限制設(shè)為 50181。 ? 這三種染料可對 SDSPAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約 30~60min完成，靈敏度為 2~10ng。 ? 速度快 (5~15min)， 蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如 EDTA 或 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì) 。 聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測 理想顯色劑的 7S ? 安全 (safety)； ? 靈敏 (sensitivity)； ? 簡單 (simplicity)； ? 特異性 (specificity)； ? 快速 (speed)； ? 穩(wěn)定 (stability)； ? 兼容性 (synergy)。 ? IPG 膠條平衡好后，一般將膠條在電泳緩沖夜里浸一下，這樣一方面可以清洗膠條去除膠條上的平衡液，另一方面，潤濕的膠條也容易沿著玻璃板推到 SDSPAGE膠上端。一般原則是：根據(jù)膠條的 pH范圍和上樣量的多少，總電壓時間積可以在一定的范圍內(nèi)調(diào)整。 ? 泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入 IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的 IEF。 5. 雙向凝膠電泳技術(shù)流程 IPG重泡漲及樣品加樣 第一向等電聚焦 第二向 SDSPAGE 檢測 問題及解決辦法 IPG膠條的重泡脹 ? 重泡漲時間至少要 10h， 泡漲不充分會影響相對分子量較高的蛋白質(zhì)的吸收 。 ? 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。配套電源為 Power Pac 1000：在進(jìn)行電泳時，最大電壓不超過 1000V，最大功率不超過 80W，最大室溫不超過 50℃ 。此時分離的蛋白質(zhì)點可進(jìn)行點的切取、蛋白酶消化、 MALDITOFMS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息。 移動過程中 ， 蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子 ， 并隨著移動的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。 生物學(xué)問題的提出 實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計 實驗組和對照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點的切取 胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化 質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析 質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對 新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 其它實驗的進(jìn)一步驗證 蛋白信息的初步獲得 蛋 白 質(zhì) 組 分 析 流 程 蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線 蛋白質(zhì)樣品的制備 雙向電泳 圖像分析 轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白 凝膠中的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 蛋白質(zhì)質(zhì)量 N端測序 肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù) 肽指紋圖 數(shù)據(jù)搜索 新的或已知蛋白 蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定 2. 雙向電泳技術(shù)的發(fā)展及原理 ? 雙向凝膠電泳的發(fā)展 ? 雙向凝膠電泳的基本原理 雙向凝膠電泳的發(fā)展 雙向凝膠電泳的思路最早是由 Smithies 和 Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Twodimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白質(zhì)第一向電泳是根據(jù)其自由溶液遷移率 (freesolution mobility)，在濾紙條上進(jìn)行；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)行。 此項 技術(shù)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離并展示的分離技術(shù)，一般能分離 1000 – 3000個蛋白質(zhì)點，最好的膠能分離得到 11000個左右的蛋白質(zhì)點。目前常使用預(yù)制膠條 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG 膠條在含有 SDS 的緩沖液中平衡。 ? 非變性 2DPAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的； ? 非變性 /SDS2DPAGE：第一向采用非變性 IEF，之后在 2% SDS溶液中平衡；第二向也在 SDS存在的條件下進(jìn)行。 BIORAD公司 PROTEAN IEF Cell 等電聚焦儀： Amersham pharmcia Biotech公司 IPGphor等電聚焦儀： 電極區(qū)域為銅鍍金板 ； 最多上 12個樣品 ； 平臺溫度為 1825℃ 177。 圖像分析軟件： ? Amersham pharmcia Biotech公司： imageMasterTM 2D version: ? BIORAD公司： PDQuesTM 4. 雙向電泳分析中的樣品制備 ? 應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 其中窄范圍堿性 IPG膠 （ 如 pH1012) 的挑戰(zhàn)是克服反向 、 陰極向陽極 、 電滲流和水平條紋模式 ， 而寬范圍的堿性 IPG膠 （ 如 pH31 412) 等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液 。 ? 商品化的膠條使用前是以干膠條的形式和塑料支撐薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液
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