基于脂蛋白納米載體的小干擾rna靶向遞送方法研究_畢業(yè)論文(文件)
【正文】 escence uptake is represented by the graphs. *P .05 pared with untagged siRNA/rHDL. Hamp。這個(gè)遞送方法不僅高效的，而且具有選擇性和生物相容性。在卵巢癌患者中， FAK 的過度表達(dá)與腫瘤相關(guān)功能在所有存活者中 并不明顯。減少血管生成的生物效應(yīng)， 繼發(fā)于腫瘤細(xì)胞的 STAT3沉默，這點(diǎn)已經(jīng)得到支持，是通過 STAT3激活劑來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。 STAT3是一個(gè)良好的轉(zhuǎn)錄因子，涉及到腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的許多關(guān)鍵過程。在目前研究中， rHDL 納米粒的吸收主要局限于腫瘤和肝。 遞送 siRNA 的 rHDL 傳輸系統(tǒng)具有許多的優(yōu)點(diǎn)。為了克服這些障礙 ,選擇性生物相容性的運(yùn)載系統(tǒng)是必要的。 Figure of STAT3 silencing on apoptosis. STAT3 was silenced using STAT3specific siRNA in (A)SKOV3ip1 and (B) HeyA8MDR cells with and without docetaxel treatment, and apoptosis was assessed using flow cytometry (annexin V). Average percent apoptosis (Annexin 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 V/PE–positive SKOV3 cells) and average percent apoptosis pared with control (annexin V/PE–positive HeyA8MDR cells) are reported. Error bars, SEM 討論 本研究的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)就是在體內(nèi) rHDL 納米粒能有效地傳遞 siRNA 以沉默基因，這些基因?qū)Π┌Y的增長和發(fā)育很重要。 STAT3沉默用免疫印跡分析證實(shí) (圖 W3A)。STAT3基因沉默大量減少了關(guān)鍵生存基因，這些基因主要用來調(diào)節(jié) MAP 激酶和AKT 通路（圖 4）。這兩組間有 460個(gè)基因表達(dá)差異。因此，我們在SKOV3ip1卵巢癌模型中用 TUNEL 染色法 (圖 3)，在 HeyA8MDR 模型活化型半胱天冬酶染色法 (圖 W6)研究了腫瘤細(xì)胞的凋亡效果。在 SKOV3ip1模型 ,STAT3 siRNA / rHDL 或多烯紫杉醇單藥治療 在 MVD(圖 3)產(chǎn)生 66%至 69%的降低 (P )。與對(duì)照組比較， STAT3 siRNA / rHDL 和多烯紫杉醇聯(lián)合治療可抑制 48%腫瘤細(xì)胞增殖 (P )(圖 3)。聯(lián)合治療顯著減少腫瘤重量 (96%， P )，腫瘤節(jié)的數(shù)量 (74%， P )。在兩個(gè)不同治療組中，動(dòng)物體重或肝功能測試（ AST 和 ALT 比值）沒有顯著差異（圖 W5 ， A基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 和 B ）。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，我們常用細(xì)胞毒性，奧沙利鉑，偶聯(lián) STAT3 siRNA / rHDL。相比于對(duì)照組和多烯紫杉醇單藥療法， STAT3 siRNA / rHDL 是否偶聯(lián)多烯紫杉醇都能顯著降低上腹部和薄壁肝組織的轉(zhuǎn)移。 STAT3 siRNA / rHDL 單藥療法使腫瘤生長減少了 76%(P)。在SKOV3ip1模型中結(jié)果類似 (圖 2 B)。我們首先用 STAT3 siRNA / rHDL 靶向STAT3(圖 2 B)。另一個(gè)關(guān)于癌癥生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因， FAK 也具有類似的結(jié)果 (圖 W3C)。接下來，檢測在體內(nèi)沉默STAT3基因的有效劑量。 rHDL 納米粒在肝臟中的吸收最高，而在大腦、心臟、肺、腎、或脾中吸收很少。熒光標(biāo)記 (Alexa555)siRNA 被包入到 rHDL 納米粒子，并進(jìn)行 IV 或 IP(圖 2)。用 RTPCR 也檢測了一些細(xì)胞系 (圖 1 D)。因?yàn)闃悠穬?chǔ)存兩周并再次透析后 siRNA 沒有從 rHDL 損失。反義寡賴氨酸多肽含有大約 40賴氨酸殘基，這可使 siRNA 偶聯(lián)到 rHDL。我們使用 SPSS 和GraphPadPrism 軟件對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行 處。小鼠在第 2， 4或 6天解剖 。約 HeyA8模型 3周后或 SKOV3ip1和 HEYA8 MDR 5周后，解剖小鼠，收集腫瘤 。所有的實(shí)驗(yàn)都是由 MD 安德森癌癥中心機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用 委員會(huì)批準(zhǔn)。 熒光染色 取新鮮冰凍得原位卵巢癌模型（ SKOV3ip1 ）的腫瘤組織 ，置于丙酮中，用 PBS 洗滌，并用 Hoechst （ 1:10,000 ）復(fù)染。凋亡小體通過綠色熒光表示。為了定量微血管密度，細(xì)胞增殖指數(shù) (ki 67)和 半胱氨酸蛋白酶 3清除率 ， 5個(gè)隨機(jī)區(qū)域每個(gè)腫瘤放大 100倍進(jìn)行研究 。肌動(dòng)蛋白或黏著斑蛋白證實(shí)相同的負(fù)載量 。 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 蛋白質(zhì)印跡分析 用改良放射免疫沉淀裂解緩沖液制備細(xì)胞裂解液。人類肝中的 cDNA 利用 SRB1表達(dá)作為陽性對(duì)照組。根據(jù)廠家的建議使用RNAiFect 轉(zhuǎn)染試劑 ,該細(xì)胞置于一式三份含 STAT3( g)或?qū)φ?siRNA( g)的 10厘米細(xì)胞培養(yǎng)板。分別使用 1: siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照 siRNA 和 STAT3 siRNA 組無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 h。 ），和一個(gè)非定標(biāo)性的控制序列（靶序列的 539。 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 體外基因沉默 STAT3 （靶序列 539。 HeyA8MDR 細(xì)胞在添加有15%的 FBS 和 300 ng / ml 紫杉醇以及 %硫酸慶大霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。 細(xì)胞系和 培養(yǎng)條件 衍生和源于人體上皮卵巢癌細(xì)胞系的 HeyA8 ， SKOV3ip1， HeyA8 MDR細(xì)胞系在之前已有研究。簡單地說， 1ml 的納米粒加入 1ml 的比色皿中作 zeta 電勢檢測 。 4 ℃孵育 12h， 接著用 2L 的 PBS 透析 2天，換 3次透析緩沖液。 5mg 的 siRNA 用 25μ g 低聚賴氨酸（平均分子量基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 為 50020xx ）在 30℃預(yù)先孵育 30分鐘，然后加入到脂質(zhì)成分中。 原料與方法 rHDL 納米粒的制 備和 siRNA 的偶聯(lián) siRNA 偶聯(lián)到 rHDL 納米粒，并儲(chǔ)存在 20176。因此，使用小分子抑制劑或其他非特異性靶向 STAT3的手段可能會(huì)導(dǎo)致許多不必要的副作用，因此需要有效途徑限制毒性。 siRNA基因沉默治療非常有效，其他方法很難靶向這些基因。然而，在惡性腫瘤細(xì)胞中 SR B1非常顯著表達(dá)。該 rHDL納米粒的組成部分有磷脂酰膽堿，載脂蛋白 A 1 ，膽固醇和膽甾醇酯（圖 1A）。此外，眾所周知， HDL納米粒可以逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吸收，比大多數(shù)藥物制劑或 其他脂蛋白，他們在循環(huán)中表現(xiàn)出更長的滯基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 留時(shí)間。因此， 需要新型，更具有特定性的方法以 系統(tǒng)遞 送 siRNA。 介紹 RNA干擾（ RNAi） 逐漸被認(rèn)為是一種 潛在 ，高 效的治療途徑。這里 ,我們證實(shí) rHDL納米粒子促進(jìn)了 siRNA體內(nèi)高效遞送?；谥鞍准{米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向 遞送方法研究 摘要 RNA干擾作為 一種 治療途徑尤其是惡性腫瘤的治療具有巨大潛力。本文利用這種細(xì)胞特性來實(shí)現(xiàn)高效 siRNA遞送， 通過 siRNA偶聯(lián)重組成 HDL(rHDL)納米粒子建立一種新型的 siRNA制劑 。這種新型技術(shù)可以作為新型癌癥治療方法的基礎(chǔ)。雖然 一些 使用脂質(zhì)體或其它納米粒子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方法也已經(jīng)報(bào)道， 但是因 毒性和其他因素其治療應(yīng)用受到限制。關(guān)于內(nèi)源性， HDL納米粒是完全可生物降解的
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