【正文】 各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間 　　變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 引物延伸　　引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。 　　（四）PCR中的污染和假陽性 　　PCR中污染主要來自 　　樣品間交叉污染； 　　先前PCR產(chǎn)物遺留（carryover） [編輯本段][PCR儀器]　　pcr儀器的發(fā)展 　　pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。國產(chǎn)1109型dna擴(kuò)增儀則是用恒溫浴機(jī)械手移位式。在采用這些儀器作pcr試驗(yàn)之前，一般均應(yīng)實(shí)測(cè)管內(nèi)溫度變化循環(huán)情況，以了解升、降溫時(shí)管內(nèi)因熱傳導(dǎo)造成的溫度滯后情況和實(shí)際到達(dá)的最高、最低溫度，用于修正設(shè)計(jì)的循環(huán)參數(shù)。 　　假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 　　物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。 　　假陽性 　　出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 　　靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。連接用5ul 2X連接液,50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。 　　2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 　　如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。 　　3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？ 　　A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。T4DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。為此，將插入片段和pGEMT正對(duì)照混合，再連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生。詳情查pGEMT pGEMT Easy載體技術(shù)資料（TM042）。 　?、谝飻U(kuò)增跨度： 以200500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 　　⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。 　　dNTP的質(zhì)量與濃度　dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 　　Mg2+濃度　Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+～。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。 　?、垩由鞙囟扰c時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子 　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子 　　高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。 　　圖2 三間PCR實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置 　　按國家衛(wèi)生部的要求，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)?標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)?擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)　　各工作區(qū)域必須配備排風(fēng)扇、空調(diào)、耐腐蝕地面和工作臺(tái)面、更衣柜、鞋柜、專用辦公用品、專用工作服和工作鞋、移動(dòng)紫外燈等，保證安全衛(wèi)生需要。當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。22 / 22。PCR實(shí)驗(yàn)室通過驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個(gè)以上持有“臨床基因檢測(cè)上崗證”。 （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)　　 全自動(dòng)定量核酸擴(kuò)增儀（含計(jì)算機(jī)、打印機(jī)） 　　 微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　 可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 　　 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　 專用工作服和工作鞋 　　 專用辦公用品 　　各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。工作區(qū)的墻面、地面、辦公用品等必須選用耐消毒藥品腐蝕的材料。 [編輯本段]PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法實(shí)驗(yàn)室布局　　PCR實(shí)驗(yàn)室按規(guī)定需要四間，分別是1 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、2 標(biāo)本制備區(qū)、3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),布局見圖1。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： 　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　復(fù)性溫度=Tm值(5～10℃) 　　在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。 　?、僮冃詼囟扰c時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。 　　PCR反應(yīng)條件的選擇 　　PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。～，小量分裝，20℃冰凍保存。 　　酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 　　D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEMT或pGEMT Easy載體克隆所需。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEMT或pGEMT Easy載體3`T缺失。 　　4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？ 　　A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4℃過夜。 　　C）如用pGEMT正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生2040藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。 　　B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。在這2種溫度下，缺T凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 　　反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 　　模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。對(duì)于配用制冷機(jī)式半導(dǎo)體元件致冷的儀器，