【正文】 在使用低于室溫的溫度來保冷pcr反應后小管時，應注意冷凝水的問題，勿使流入儀器內(nèi)浸濕半導體元件而損壞儀器。ptc51a/b體積小，智能化與自動化程序高，可以兼做套式pcr，方便實用。在短短的幾年間，擴增儀經(jīng)過幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發(fā)展。 循環(huán)數(shù)　　大多數(shù)PCR含2540循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。然后在此次實驗基礎上做出預估?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。如圖所示： 　　現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。 PCR反應條件的控制　?、貾CR反應的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子 　　②鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，　?、鄣孜餄舛?dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L 　　④TaqDNA聚合酶 （100ul） 　?、菀? ～ 　?、薹磻獪囟群脱h(huán)次數(shù) 　　變性溫度和時間 95℃，30s 　　退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 　　延伸溫度和時間 72℃，1min/kb（10kb內(nèi)） 　　Tm值=4(G+C) ＋2(A+T) 　　循環(huán)次數(shù) :一般為25 ～ 30次。 　　標本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸。 　　v 引物設計軟件 　　Primer （自動搜索）* 　　vOligo6 （引物評價） 　　vVector NTI Suit 　　vDNAsis 　　vOmiga 　　vDNAstar 　　vPrimer3 （在線服務） 模板的制備　　PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 　?、菀锱c非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。 　?、谝飰A基：G+C含量以4060%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。 　　引物有多種設計方法，與PCR在實驗中的目的決定。 　　PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的最重要技術(shù)。他發(fā)表了第一個單純且短暫性基因復制（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。 　　DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實用性的Klenow 　　 PCR流程fragment of E. Coli則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性,因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。 所屬學科： 細胞生物學(一級學科) ；細胞生物學技術(shù)(二級學科) 定義4：由穆利斯(K. B. Mullis)于1988年首創(chuàng)的一種在體外模擬發(fā)生于細胞內(nèi)的DNA快速擴增特定基因或DNA序列的復制過程的技術(shù)。聚合酶鏈式反應 科技名詞定義中文名稱：聚合酶鏈式反應 英文名稱：polymerase chain reaction。粘性末端連接：酶切克?。涸赑CR引物的5’端引入與載體匹配，不同識別位點的限制性內(nèi)酶切位點，載體使用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切，進行連接，通?？梢缘玫蕉ㄏ蚩寺〉慕Y(jié)果。平滑末端連接：載體為平末端，可用 EcoR V或Sma I酶切，同時為了防止載體自連，對載體做了去磷酸處理。(7) 取5μl樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結(jié)果。(3) 14000rpm 離心5min，吸上清液，加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3min。(11) 取5μL樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉(zhuǎn)化子。(7) 棄濾液，將DNAprep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，加入700μl已加無水乙醇的Buffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的BufferW2洗滌一次。(4) 加入400μl Buffer S3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)810次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。方案二 質(zhì)粒PCR1. 堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA(1) 用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。3． 重組質(zhì)粒的鑒定方案一 菌落PCR(1) 制備PCR混合液：(2) 用經(jīng)滅菌的10μl槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3) 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。(5) 將200μl 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml Xgal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落進行鑒定。2. 重組DNA的轉(zhuǎn)化(1) 將含Amp、XGal、IPTG的LB平板37℃預熱。(2) 4℃，5000rpm離心2min，去上清液。 因此采取折中的溫度，即1216℃，連接1216h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進行，這樣就導致了大量的自連接產(chǎn)物。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。 重組T質(zhì)粒的構(gòu)建一．原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子?！⊙芤种扑?angiostatin ,簡稱AGN) 是纖溶酶原的一個酶解片段,相當于其1～4 Kringle 區(qū),具有抑制內(nèi)皮細胞增殖、抑制血管生成及抑制多種類型腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的生物功能,是一種新型血管生成抑制因子[1 , 2 ] ,對于控制腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、消化道潰瘍、關(guān)節(jié)炎等病理性血管生成具有重要的研究價值和應用前景.PCR產(chǎn)物的T載體克?。ㄒ唬┻x擇基因表達系統(tǒng)主要考慮的是保證表達的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達的量和分離純化的難易。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達。此階段是將實驗室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。 兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。因為DNA片斷有兩個端點，所以切割時出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。通過這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。（二） 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定1 材料 JM109菌株2 儀器、用具超凈工作臺、離心機、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器3 試劑(1) CaClLB平板（見附錄）；SOC培養(yǎng)基（見附錄）；SOB培養(yǎng)基(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；無水乙醇的Buffer W2a(3) 1電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心]；瓊脂糖；6加樣緩沖液(4) 酚；氯仿；異戊醇(5) ddH2O；10PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13；TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(1) 取大腸桿菌JM109保存液50μl，接種于4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37℃，300rpm振蕩培養(yǎng)過夜，第二天取50μl 轉(zhuǎn)接到新的4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)3h至OD600=～，冰浴10min。(5) 加入100μl CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4℃保存?zhèn)溆谩?4) 在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300μl，槍頭混勻，37℃、150rpm溫和搖振60min。③ 菌液涂皿操作時，應避免反復來回涂布，因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。(6) 取5μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進