【正文】 度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。②減少dNTP的濃度。在這2種溫度下，缺T凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。 　　B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。 　　C）如用pGEMT正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生2040藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEMT或pGEMT Easy載體3`T缺失。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗?！?，小量分裝，20℃冰凍保存。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。 　?、僮冃詼囟扰c時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： 　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　復(fù)性溫度=Tm值(5～10℃) 　　在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。 [編輯本段]PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法實(shí)驗(yàn)室布局　　PCR實(shí)驗(yàn)室按規(guī)定需要四間，分別是1 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、2 標(biāo)本制備區(qū)、3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),布局見圖1。 （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)　　 全自動(dòng)定量核酸擴(kuò)增儀（含計(jì)算機(jī)、打印機(jī)） 　　 微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　 可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面） 　　 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　 專用工作服和工作鞋 　　 專用辦公用品 　　各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。22 / 22。 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)　　各工作區(qū)域必須配備排風(fēng)扇、空調(diào)、耐腐蝕地面和工作臺(tái)面、更衣柜、鞋柜、專用辦公用品、專用工作服和工作鞋、移動(dòng)紫外燈等，保證安全衛(wèi)生需要。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 　　dNTP的質(zhì)量與濃度　dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。詳情查pGEMT pGEMT Easy載體技術(shù)資料（TM042）。為此，將插入片段和pGEMT正對照混合，再連接。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。 　　3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗(yàn)？ 　　A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。連接用5ul 2X連接液,50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。 　　靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。 　　物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。 　　假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。國產(chǎn)1109型dna擴(kuò)增儀則是用恒溫浴機(jī)械手移位式。 引物延伸　　引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。 [編輯本段]［PCR反應(yīng)特點(diǎn)］特異性強(qiáng)　　PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 　?、僖锱c模板DNA特異正確的結(jié)合； 　?、趬A基配對原則； 　?、跿aq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 　?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。 　?。?0℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。 　?、咭锏? ′端可以修飾。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 [編輯本段]［PCR原理］　　DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。 所屬學(xué)科： 生態(tài)學(xué)(一級學(xué)科) ；分子生態(tài)學(xué)(二級學(xué)科) 定義2：體外酶促合成特異脫氧核糖核酸片段的技術(shù)?；?qū)⒎瞧侥┒说腜CR產(chǎn)物使用DNA聚合酶進(jìn)行平末端處理。(5) 14000rpm離心5min，吸上清液，混勻后20℃放置15min，沉淀質(zhì)粒DNA。(9) 連濾液一并棄掉收集管，將DNAprep Tube 離心管中，在silica 膜中央加入2530μl Eluent或去離子水。(3) 加入250μl Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合46次，此步驟不宜超過5min。② 42℃熱處理時(shí)很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。(4) 4℃，5000rpm離心2min，棄上清液。二．材料與方法1 材料外源DNA片斷2 儀器、用具移液槍、碎冰3 試劑pMD 18T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法連接體系如下：16℃連接過夜。一旦有外源片斷插入時(shí)，由外源片斷提供5’端就能與載體進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。 此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。為了減少自環(huán)的高本底，可對載體進(jìn)行5’除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3’OH末端與5’端，所以除磷后載體不會(huì)自環(huán)。Taq DNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pGEMT Easy Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。(3) CaCl2重懸菌體，冰浴30min。注意事項(xiàng)：① 制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作，同時(shí)注意近火無菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。(2) 用250μl已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。(8) 棄濾液，將DNAprep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，14000rpm離心1min。(4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，靜置3min。PCR產(chǎn)物為磷酸化的平末端產(chǎn)物：一般高保真聚合酶擴(kuò)增得到，高保真聚合酶有很強(qiáng)的3’→5’外切酶活性。PCR 定義1：用引物和DNA聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增特定的DNA區(qū)域的一種技術(shù)?，F(xiàn)今所使用的酶(簡稱Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermusaquaticus）分離出來的。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)