【正文】 度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。②減少dNTP的濃度。在這2種溫度下，缺T凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。 　　B）轉化完整質粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉化效率。 　　C）如用pGEMT正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生2040藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEMT或pGEMT Easy載體3`T缺失。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗?！?，小量分裝，20℃冰凍保存。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。 　?、僮冃詼囟扰c時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： 　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 　　復性溫度=Tm值(5～10℃) 　　在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。 [編輯本段]PCR實驗室的建立方法實驗室布局　　PCR實驗室按規(guī)定需要四間，分別是1 試劑儲存和準備區(qū)、2 標本制備區(qū)、3擴增反應混合物配制和擴增區(qū)、4擴增產(chǎn)物分析區(qū),布局見圖1。 （三）基因擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)　　 全自動定量核酸擴增儀（含計算機、打印機） 　　 微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　 可移動紫外燈（近工作臺面） 　　 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　 專用工作服和工作鞋 　　 專用辦公用品 　　各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。22 / 22。 設置標準　　各工作區(qū)域必須配備排風扇、空調(diào)、耐腐蝕地面和工作臺面、更衣柜、鞋柜、專用辦公用品、專用工作服和工作鞋、移動紫外燈等，保證安全衛(wèi)生需要。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 　　dNTP的質量與濃度　dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。詳情查pGEMT pGEMT Easy載體技術資料（TM042）。為此，將插入片段和pGEMT正對照混合，再連接。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。 　　3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？ 　　A）涂布未轉化的感受態(tài)細胞。連接用5ul 2X連接液,50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。 　　靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。 　　物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。 　　假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 　　PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及溴乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。國產(chǎn)1109型dna擴增儀則是用恒溫浴機械手移位式。 引物延伸　　引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。 [編輯本段]［PCR反應特點］特異性強　　PCR反應的特異性決定因素為： 　?、僖锱c模板DNA特異正確的結合； 　　②堿基配對原則； 　?、跿aq DNA聚合酶合成反應的忠實性； 　　④靶基因的特異性與保守性。 　?。?0℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。 　?、咭锏? ′端可以修飾。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 [編輯本段]［PCR原理］　　DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。 所屬學科： 生態(tài)學(一級學科) ；分子生態(tài)學(二級學科) 定義2：體外酶促合成特異脫氧核糖核酸片段的技術?；驅⒎瞧侥┒说腜CR產(chǎn)物使用DNA聚合酶進行平末端處理。(5) 14000rpm離心5min，吸上清液，混勻后20℃放置15min，沉淀質粒DNA。(9) 連濾液一并棄掉收集管，將DNAprep Tube 離心管中，在silica 膜中央加入2530μl Eluent或去離子水。(3) 加入250μl Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉混合46次，此步驟不宜超過5min。② 42℃熱處理時很關鍵，轉移速度要快，且溫度要準確。(4) 4℃，5000rpm離心2min，棄上清液。二．材料與方法1 材料外源DNA片斷2 儀器、用具移液槍、碎冰3 試劑pMD 18T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法連接體系如下：16℃連接過夜。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5’端就能與載體進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質量控制。 此階段的工作主要在實驗室內(nèi)完成。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。為了減少自環(huán)的高本底，可對載體進行5’除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3’OH末端與5’端，所以除磷后載體不會自環(huán)。Taq DNA酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEMT Easy Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質粒。(3) CaCl2重懸菌體，冰浴30min。注意事項：① 制備感受態(tài)細胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態(tài)細胞受雜菌污染。(2) 用250μl已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細菌沉淀。(8) 棄濾液，將DNAprep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，14000rpm離心1min。(4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，靜置3min。PCR產(chǎn)物為磷酸化的平末端產(chǎn)物：一般高保真聚合酶擴增得到，高保真聚合酶有很強的3’→5’外切酶活性。PCR 定義1：用引物和DNA聚合酶進行體外擴增特定的DNA區(qū)域的一種技術。現(xiàn)今所使用的酶(簡稱Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細菌（Thermusaquaticus）分離出來的。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。PCR由變性退火延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性退火延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。所以實際使用時根據(jù)