【正文】 用、高智能化和自動化的方向發(fā)展。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預估。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。 　　標本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸。 　?、菀锱c非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。 　　PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學研究的最重要技術(shù)。 　　DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實用性的Klenow 　　 PCR流程fragment of E. Coli則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性,因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應(yīng)。聚合酶鏈式反應(yīng) 科技名詞定義中文名稱：聚合酶鏈式反應(yīng) 英文名稱：polymerase chain reaction。平滑末端連接：載體為平末端，可用 EcoR V或Sma I酶切，同時為了防止載體自連，對載體做了去磷酸處理。(3) 14000rpm 離心5min，吸上清液，加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3min。(7) 棄濾液，將DNAprep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，加入700μl已加無水乙醇的Buffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的BufferW2洗滌一次。方案二 質(zhì)粒PCR1. 堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA(1) 用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。(5) 將200μl 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml Xgal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落進行鑒定。(2) 4℃，5000rpm離心2min，去上清液。因此采取折中的溫度，即1216℃，連接1216h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進行，這樣就導致了大量的自連接產(chǎn)物。 重組T質(zhì)粒的構(gòu)建一．原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。選擇基因表達系統(tǒng)主要考慮的是保證表達的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達的量和分離純化的難易。此階段是將實驗室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。通過這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。（二）(5) 加入100μl CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4℃保存?zhèn)溆?。?菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復來回涂布，因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。*Buffer S2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。(10) 室溫靜置2 min，14000rpm離心1min洗脫DNA。(6) 14000rpm離心13min，棄上清液，沉淀加入200μL 70%乙醇洗滌一次，室溫干燥，用20μL去離子雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA沉淀，20℃保存待用。對于平末端的PCR產(chǎn)物還需要進行磷酸化處理，使其5’磷酸化。 所屬學科： 水產(chǎn)學(一級學科) ；水產(chǎn)生物育種學(二級學科) 定義3：通過DNA互補雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環(huán)來擴增DNA特定序列的方法。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。 [編輯本段][PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件]　　 10擴增緩沖液10μl4種dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA～2μgTaq DNA聚合酶 μlMg2+加雙或三蒸水100 μl　PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即: 　　引物(PCR引物為DNA片段，細胞內(nèi)DNA復制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。 　　引物設(shè)計的基本原則 　　①引物長度：1530bp，常用為20bp左右。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。 　　每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。 　　其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。 對標本的純度要求低　　不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略 　　延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。更接近于手工操作。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。室溫保溫1小時，或4℃過夜。 　　如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。轉(zhuǎn)化率為： 　　1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 　　轉(zhuǎn)化pGEMT應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞 　　如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。 　　E）高度重復序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞 　　PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 　　標準的PCR反應(yīng)體系： 　　10擴增緩沖液 10ul 　　4種dNTP混合物 各200umol/L 　　引物 各10～100pmol　 　　模板DNA ～2ug　 　　Taq DNA聚合酶 　 　　Mg2+　　　加雙或三蒸水至 100ul 　　PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 　　引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。 　?、菀?39。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 　　根據(jù)國家衛(wèi)生部《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》，各工作區(qū)域必備儀器設(shè)備如下： （一） 試劑儲存和準備區(qū)　　28℃和15℃冰箱 　　混勻器 　　微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　移動紫外燈（近工作臺面） 　　消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　專用工作服和工作鞋 　　專用辦公用品 （二）標本制備區(qū)　　28℃冰箱、20℃或80℃冰箱 　　高速臺式冷凍離心機 　　混允器 　　水浴箱或加熱模塊 　　微量加樣器（覆蓋11000μl） 　　可移動紫外燈（近工作臺面） 　　超凈工作臺 　　消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 　　專用工作服和工作鞋 　　專用辦公用品 　　如需處理大分子DNA，應(yīng)具有超聲波水