【正文】 mer annealing） 4. 引物延伸 5. 循環(huán)數(shù) 6. 最后延伸[PCR儀器] PCR實(shí)驗(yàn)室的建立方法 1. 實(shí)驗(yàn)室布局 2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) 3. （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) 4. （二）標(biāo)本制備區(qū) 5. （三）基因擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)[概述]［PCR原理］[PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件] 1. 2. PCR引物設(shè)計(jì) 3. 模板的制備 4. PCR反應(yīng)條件的控制［PCR步驟］ 1. 2. 3. ［PCR檢測(cè)］［PCR反應(yīng)特點(diǎn)］ 1. 特異性強(qiáng) 2. 靈敏度高 3. 簡(jiǎn)便、快速 4. 對(duì)標(biāo)本的純度要求低［PCR的循環(huán)參數(shù)］ 1. 預(yù)變性（Initial denaturation） 2. 循環(huán)中的變性步驟 3. 引物退火（Primer annealing） 4. 引物延伸 5. 循環(huán)數(shù) 6. 最后延伸[PCR儀器]因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。 最后延伸　　在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持515分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。⑤模板核酸變性不徹底。 　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4℃過(guò)夜。可能是連接酶污染了核酸酶。 　　設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 　?、僖镩L(zhǎng)度： 1530bp，常用為20bp左右。多次凍融會(huì)使dNTP降解。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。 　　圖1 四間PCR實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置 　　如果使用全自動(dòng)分析儀，各區(qū)域可適當(dāng)合并，我們建議將擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)合并為擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)即共三個(gè)間，布局見(jiàn)圖2。PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國(guó)家衛(wèi)生部的要求，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。 　　溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性退火延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。 　　鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。應(yīng)測(cè)定比值范圍。 　　出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 　　PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 　　國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的幾種dna擴(kuò)增儀 　　1109型 　　北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合 　　機(jī)械臂 　　變溫水浴 　　電子調(diào)溫 　　40 　　16400元/臺(tái) 　　90a/b型 　　中科院遺傳所 　　機(jī)械臂 　　變溫水浴 　　電熱 　　14000元/臺(tái) 　　ptc51a/b型 　　軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 　　變溫氣流 　　電子調(diào)兼作套式 　　30 　　12000元/臺(tái) 　　dna thermal cycler 　　perkin –elmercetus(美) 　　變溫鋁塊 　　壓縮機(jī)致冷 　　48 　　us $ 　　thermocycler 　?。?0 　　＃00 　?。?80 　　b..braun 　　biotech 　　(德) 　　變溫水浴98℃四檔 　　電熱,自來(lái)水冷卻 　　60 　　100 　　180 　　dm 　　automatic temperature cycler single block twin block 　　erip inc.(美) 　　變溫鋁塊25～100℃ 　　電熱,自來(lái)水冷卻 　　29 　　58 　　us $ 　　us $ 　　grant autogen 　　grant instrumant ltd(美) 　　變溫水浴0～99℃ 　　電熱,自來(lái)水冷卻或加冷循環(huán)器 　　50 　　or 　　50 　　us $250. –plus 　　us $ 　　rack(x2) 　　techne phc1 　　phc2 　　techne ltd.(英) 　　變溫鋁塊0～99℃三檔 　　電熱500w水冷100w 　　54 　　54 　　24 　　￡3383. – 　　￡3997. 　　biooven 　　biothrm corp(美) 　　變溫氣流 　　150℃ 　　115v 11a 　　200’s of 496plate 　　us $ 2990. 　　triothermoblock tb1 　　biomertra(德) 半導(dǎo)體變溫 　　220v 　　320管 　　分別控溫 　　dm12900. 　　micro cycler e 　　eppendorf(美) 變溫鋁塊 　　220v/100v 　　329管 　　us $ 3500. 　　［PCR常見(jiàn)問(wèn)題］ 　　PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 　　一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。 　　退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。近年來(lái)以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇 　　模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制 　　緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見(jiàn)的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu) PCR引物設(shè)計(jì)　　PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR 定義1：用引物和DNA聚合酶進(jìn)行體外擴(kuò)增特定的DNA區(qū)域的一種技術(shù)。(4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，靜置3min。(2) 用250μl已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。(3) CaCl2重懸菌體，冰浴30min。為了減少自環(huán)的高本底，可對(duì)載體進(jìn)行5’除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3’OH末端與5’端，所以除磷后載體不會(huì)自環(huán)。 此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。二．材料與方法1 材料外源DNA片斷2 儀器、用具移液槍、碎冰3 試劑pMD 18T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法連接體系如下：16℃連接過(guò)夜。② 42℃熱處理時(shí)很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。(9) 連濾液一并棄掉收集管，將DNAprep Tube 離心管中，在silica 膜中央加入2530μl Eluent或去離子水?；?qū)⒎瞧侥┒说腜CR產(chǎn)物使用DNA聚合酶進(jìn)行平末端處理。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 　　⑦引物的5 ′端可以修飾。 　?。?0℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。國(guó)產(chǎn)1109型dna擴(kuò)增儀則是用恒溫浴機(jī)械手移位式。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。 　　靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。 　　3)如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？ 　　A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。為此，將插入片段和pGEMT正對(duì)照混合，再連接。端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。SDS的主要功能是： 溶解