【正文】 Biotech生產(chǎn) 。 結(jié)構(gòu)式圖?。。?！ 葡聚糖凝膠的交聯(lián)程度（簡(jiǎn)稱(chēng)交聯(lián)度）由環(huán)氧氯丙烷的百分比控制，它與凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑的大小有直接關(guān)系，交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越小，分離的分子量越小；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越大，分離的分子量越大。單位是 ml / g干膠）。數(shù)字越大的，分級(jí)分離范圍越大，排阻極限也越大。Sephadex G中排阻極限最大的 G200為 6?105。 Sephadex G在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在 100 ?C下 40 min對(duì)凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒(méi)有明顯的影響。 Sephadex G有各種顆粒大?。ㄒ话阌写?、中、細(xì)、超細(xì)）可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差；細(xì)顆粒流速慢，但分辨率高。 LH型葡聚糖凝膠與 G型葡聚糖凝膠相比較區(qū)別在于：一般以 G型葡聚糖凝膠（經(jīng)水溶液溶脹）作為固定相，以水溶液作為流動(dòng)項(xiàng)，對(duì)水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法稱(chēng)為葡聚糖凝膠過(guò)濾層析。是一種硬性凝膠。通過(guò)控制丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交聯(lián)度的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性比 Sephadex好，在 pH為1~10之間比較穩(wěn)定。 3. 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖是從瓊脂中分離出來(lái)的天然線性多糖。它在 100 ?C時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度降至 45 ?C以下時(shí)，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。它在室溫下保存是很穩(wěn)定的，工作在 pH 4－ 9之間是穩(wěn)定的，另外瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和孔穴的穩(wěn)定性都很好，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會(huì)發(fā)生明顯變化，因此，使用瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)洗脫速度可以更快。 Sepharose CL型凝膠還特別適合于含有有機(jī)溶劑的分離。 5. 多孔硅膠 、 多孔玻璃珠 顧名思義，它們就是將硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)的球形顆粒。另外它們也不能用于強(qiáng)堿性溶液，一般使用時(shí) pH應(yīng)小于 。其它關(guān)于各種凝膠產(chǎn)品的詳細(xì)情況可以參閱各個(gè)公司的產(chǎn)品目錄。 所謂組分分離則是指分離那些相對(duì)分子質(zhì)量之間相差較小的樣品。所謂粒度就是凝膠顆粒的大小，而與交聯(lián)度無(wú)關(guān)。 干膠用量（ g）＝柱床體積（ ml） / 膨脹度（ ml / g）。但必須避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。多孔玻璃珠和多孔硅膠不需溶脹處理。若在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)不再使用，溶液中的凝膠容易長(zhǎng)細(xì)菌，使其化學(xué)性質(zhì)發(fā)生某些變化，如發(fā)生氧化、離子化等，因此，需將其干燥保存。洗脫液另一個(gè)的目的是為了消除組分與固定相的吸附等作用。加樣過(guò)多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過(guò)少，實(shí)驗(yàn)效率低。如果所要的各個(gè)組分的洗脫峰分得很開(kāi)，為了提高效率，可以適當(dāng)增加加樣量；如果各個(gè)組分的洗脫峰只是剛好分開(kāi)或沒(méi)有完全分開(kāi)，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。一般來(lái)講，柱子越長(zhǎng)、凝膠的型號(hào)越小、粒度越小，洗脫速度越慢。 總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類(lèi)型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況來(lái)選擇。 凝膠層析的應(yīng)用 凝膠層析在不僅在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中 ， 在生物學(xué)其他領(lǐng)域也占據(jù)重要的地位 。它是依據(jù)混合樣品中各組分的相對(duì)分子量的不同來(lái)進(jìn)行分離的，有不改變樣品生物學(xué)活性的優(yōu)點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單，這使得凝膠層析成為分離純化生物大分子不可缺少的重要手段。具體的方法是：將已知分子質(zhì)量的系列混合標(biāo)準(zhǔn)品在同一凝膠柱 、 同一條件下進(jìn)行層析 ， 獲得混合標(biāo)準(zhǔn)品中每一個(gè)組分的洗脫體積 ， 然后將每一個(gè)組分的洗脫體積對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作圖 ，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 3. 脫鹽及去除小分子雜質(zhì) 在生物大分子的分離純化時(shí)，常常用鹽析等方法獲取，因此樣品中含有大量的鹽或其他小分子。 4. 去熱源物質(zhì) 熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì) 。其作用基本類(lèi)似于聚乙二醇的脫水作用，這種濃縮方法基本不改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和 pH值。 一般在制備水解蛋白 、 核苷酸 、和酶注射液時(shí) ， 常含有此類(lèi)熱源物質(zhì) ， 凝膠層析是一種簡(jiǎn)單而有效的去除方法 。一般常用的是 Sephadex G25等排阻極限較小的凝膠類(lèi)型。 用此法測(cè)定分子量可能會(huì)受到分子形狀的影響，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的偏差。另外，他還可以將相對(duì)分子質(zhì)量相近，分子結(jié)構(gòu)和形狀相似的化合物與其他分子分開(kāi)。 下面我們簡(jiǎn)單介紹幾個(gè)方面的應(yīng)用 。特別要注意的是各種條件之間的協(xié)調(diào)和配合后的綜合效果。因此，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況來(lái)選擇合適的洗脫速度，可以通過(guò)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇洗脫速度。一般可以使用恒流泵（蠕動(dòng)泵）來(lái)保持洗脫速度恒定。凝膠柱較大，加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般組分分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的 1％－ 5％左右，而組別分離時(shí)約為凝膠柱床體積的 10％－ 25％。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。注意溶脹的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會(huì)破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。 對(duì)于使用多次的凝膠柱子 ， 需要將凝膠取出 ，按預(yù)處理的方法用酸或減處理后 ， 重新裝柱即可再生 。然后用 浸泡半個(gè)小時(shí)，再用水洗至中性。 將稱(chēng)取的干凝膠放在蒸餾水中溶脹，所需的溶脹時(shí)間依據(jù)不同類(lèi)型凝膠的產(chǎn)品說(shuō)明。選擇時(shí)要依據(jù)分離的具體情況而定，例如進(jìn)行組別分離時(shí)，則可以選用粒度大的凝膠，很快達(dá)到分離的目的；進(jìn)行組分分離時(shí)，則要選用粒度小的凝膠以提高分辨率。因?yàn)榉蛛x范圍選擇過(guò)小，則某些組分不能得到分離；分離范圍選擇過(guò)大，則分辨率較低，分離效果不好。所謂組別分離是指分離那些相對(duì)分子質(zhì)量之間相差很大的樣品。 除了上述 5類(lèi)凝膠外，由于近年來(lái)各類(lèi)凝膠技術(shù)發(fā)展得很快，目前已研制出很多性能優(yōu)越的新型凝膠。它們的最大的特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度很高、化學(xué)穩(wěn)定性好，使用方便而且壽命長(zhǎng)，在較高的層析流速下，分辨率并不受影響。這樣制成的凝膠剛性好，孔徑大，理化性質(zhì)介于兩者之間。瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以 0－ 30 ?C為宜。在 Sepharose B系列產(chǎn)品中， B前面的數(shù)字表示瓊脂糖的百分比濃度，例如 Sepharose 6B表示瓊脂糖的濃度為 6%， B前面的數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，分級(jí)分離的范圍也就越小，反之亦然。其制備過(guò)程就是去除瓊脂膠留下瓊脂糖。另外，聚丙烯酰胺凝膠是一種化學(xué)合成的凝膠，不會(huì)象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長(zhǎng)微生物。所以數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，分級(jí)分離的范圍也就越大，反之亦然。所以它不僅可以用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至是質(zhì)粒、大的病毒顆粒（直徑 300400nm）。 LH型葡聚糖凝膠的主要型號(hào)為Sephadex LH20和 LH60，適用于分離脂溶性物質(zhì)，例如膽固醇、脂肪酸激素等。Sephadex G的機(jī)械穩(wěn)定性相對(duì)較差，它不耐壓，分辨率高的細(xì)顆粒要求流速較慢，所以不能實(shí)現(xiàn)快速而高效的分離。但一般在離子強(qiáng)度大于 ，幾乎沒(méi)有吸附作用。 Sephadex G穩(wěn)定工作的 pH一般為為 2－ 10。它代表該凝膠能有效分離的最大分子量，大于它的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。葡聚糖凝膠是不溶于有機(jī)溶劑和水的聚合物，但其結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基，因此， Sephadex G的親水性很好，能迅速在水中和電解質(zhì)溶液中溶脹，層析過(guò)程中與水溶性溶質(zhì)接觸非常容易。例如Sephadex G75對(duì)球形蛋白的分級(jí)分離范圍為3,000－ 70,000，它表示分子量在這個(gè)范圍內(nèi)的球形蛋白可以通過(guò) Sephadex G75得到較好的分離。 Sephadex又可分為 G型和 LH型兩類(lèi) 。下面將分別介紹。樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，各個(gè)組分按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。 凝膠層析的基本原理 凝膠層析是一種物理的分離純化手段，它是依據(jù)樣品中各組分間分子大小的差異設(shè)計(jì)的。 凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過(guò)特殊工藝合成的層析介質(zhì)。它是以具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠填料作為固定相，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻在外部，按分子量大小分離樣品中各個(gè)組分的液相色譜方法。最后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)測(cè)定結(jié)果，即