【正文】 交聯(lián)度多孔瓊脂糖珠）。其它關于各種凝膠產(chǎn)品的詳細情況可以參閱各個公司的產(chǎn)品目錄。 凝膠層析操作的具體問題 1. 凝膠的選擇 選擇凝膠時，首先要確定是組分分離還是組別分離。所謂組別分離是指分離那些相對分子質(zhì)量之間相差很大的樣品。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等，它們之間的相對分子質(zhì)量相差數(shù)十至數(shù)百倍，應選用能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，一般交聯(lián)度較大的凝膠層析介質(zhì)分離效果好，比如，葡聚糖凝膠 Sephadex G25或聚丙烯酰胺凝膠 BioGel P6等。 所謂組分分離則是指分離那些相對分子質(zhì)量之間相差較小的樣品。在進行組分分離時，要大概知道樣品各組分的相對分子質(zhì)量的最大最小值才能選擇凝膠的型號，例如分離相對分子質(zhì)量在 5000~100000之間的混合樣品，選擇凝膠的分離范圍應正好包括所需的各個組分的相對分子質(zhì)量，比如，葡聚糖凝膠 Sephadex G100等。因為分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離；分離范圍選擇過大，則分辨率較低，分離效果不好。 選擇凝膠時，其次要選擇凝膠顆粒的粒度。所謂粒度就是凝膠顆粒的大小，而與交聯(lián)度無關。粒度小，外水體積也小，裝柱易均勻，層析時渦旋擴散影響小，分辨率高，但流速慢；粒度大，外水體積也大，裝柱不易均勻，層析時渦旋擴散影響較大，分辨率低，但流速快。選擇時要依據(jù)分離的具體情況而定，例如進行組別分離時，則可以選用粒度大的凝膠，很快達到分離的目的；進行組分分離時，則要選用粒度小的凝膠以提高分辨率。 2. 凝膠的預處理 選擇好凝膠的類型和層析柱后 ， 根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度 ， 按下面的公式估算出凝膠的用量 。 干膠用量（ g）＝柱床體積（ ml） / 膨脹度（ ml / g）。 由于處理凝膠過程中可能有一定損失 ， 所以用此公式計算出的干凝膠用量還需再增加 10％ － 20％ 。 將稱取的干凝膠放在蒸餾水中溶脹，所需的溶脹時間依據(jù)不同類型凝膠的產(chǎn)品說明。如果加熱煮沸，則溶脹時間會大大縮短，一般在 1－ 5小時即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但必須避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。溶脹處理后，要對凝膠進行反復漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的粒度過小的凝膠。然后用 浸泡半個小時，再用水洗至中性。為了除去凝膠顆粒中的氣泡，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法實現(xiàn)，否則會影響分離效果。多孔玻璃珠和多孔硅膠不需溶脹處理。 3. 凝膠的再生和保存 對于剛使用的新凝膠柱子 ， 只需洗滌后重新平衡 ， 即可再生 。 對于使用多次的凝膠柱子 ， 需要將凝膠取出 ，按預處理的方法用酸或減處理后 ， 重新裝柱即可再生 。 使用過的凝膠，若要短時間保存，一般是反復洗滌去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后加入適當?shù)目咕鷦?，例如：％的疊氮化鈉、 %~%三氯丁醇、%~%乙基汞硫代水楊酸鈉、%~%苯基汞代乙酸鹽、苯基汞代硝酸鹽或苯基汞代硼酸鹽等， 4 C下保存。若在較長的時間內(nèi)不再使用，溶液中的凝膠容易長細菌，使其化學性質(zhì)發(fā)生某些變化，如發(fā)生氧化、離子化等，因此，需將其干燥保存。首先要將凝膠進行洗滌，以除去凝膠表面的污染物，然后將凝膠放在濃度由低到高的乙醇中逐級脫水（ 30%、 50%、 70%、 80%、 95%、無水乙醇），最后是乙醚，脫水后的凝膠在室溫下晾干，或置于 60 C烘箱中烘干，將乙醚揮發(fā)干，即可裝瓶保存。注意溶脹的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。 4. 洗脫液的選擇 凝膠層析所使用的洗脫液比較簡單，只是起運載工具的作用，不依賴于洗脫液性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，一般只使用一種緩沖液。洗脫液另一個的目的是為了消除組分與固定相的吸附等作用。一般來說，洗脫液的選擇只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。 5. 加樣量 加樣量也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，實驗效率低。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越小，分辨率越高。凝膠柱較大，加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般組分分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的 1％－ 5％左右，而組別分離時約為凝膠柱床體積的 10％－ 25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據(jù)洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。 6. 洗脫速度 若要維持凝膠柱的穩(wěn)定及獲得好的層析效果，需要一個恒定且合適的洗脫速度。一般可以使用恒流泵（蠕動泵）來保持洗脫速度恒定。但影響洗脫速度的因素很多，例如柱子的長度、凝膠的型號、凝膠的粒度等。一般來講，柱子越長、凝膠的型號越小、粒度越小，洗脫速度越慢。洗脫速度慢是一柄雙刃劍，它既可以使一些樣品在兩相中有充分的時間平衡，分離效果好，又可能造成樣品擴散加劇、區(qū)帶變寬，反而會降低分辨率，而且實驗時間會大大延長。因此，實驗中應根據(jù)實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是 2－ 10 cm / hr。 總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據(jù)具體的實驗情況來選擇。而且各種選擇都有一個限度的問題，超過這個限度可能會產(chǎn)生相反的效果。特別要注意的是各種條件之間的協(xié)調(diào)和配合后的綜合效果。另外需要提的一點是，實驗時應盡可能的參考相關實驗和文獻以及進行預實驗，以優(yōu)化最佳的實驗條件。 凝膠層析的應用 凝膠層析在不僅在生物化學實驗中 ， 在生物學其他領域也占據(jù)重要的地位 。 使用非常的廣泛 、 普遍 。 下面我們簡單介紹幾個方面的應用 。 1. 生物大分子的純化 凝膠層析的最主要應用應該就是對生物大分子進行純化。它是依據(jù)混合樣品中各組分的相對分子量的不同來進行分離的，有不改變樣品生物學活性的優(yōu)點，而且操作簡單，這使得凝膠層析成為分離純化生物大分子不可缺少的重要手段。它也是唯一通過分子質(zhì)量差異進行分離的技術。另外，他還可以將相對分子質(zhì)量相近，分子結(jié)構(gòu)和形狀相似的化合物與其他分子分開。 2. 分子量測定 凝膠層析用于分子量的測定是一種常用的手段 。具體的方法是：將已知分子質(zhì)量的系列混合標準品在同一凝膠柱 、 同一條件下進行層析 ， 獲得混合標準品中每一個組分的洗脫體積 ， 然后將每一個組分的洗脫體積對其相對分子質(zhì)量的對數(shù)作圖 ，獲得標準曲線 。 在同樣的條件下將未知分子量的待測樣品進行上述凝膠層析 ， 得到它的洗脫體積 ，用該體積在標準曲線上查得未知樣品的相對分子質(zhì)量的對數(shù)值 ， 從而進一步計算出該未知樣品的相對分子質(zhì)量 。 用此法測定分子量可能會受到分子形狀的影響，結(jié)果會產(chǎn)生一定的偏差。如果先前知道待測樣品的形狀，在選取標準品的時候，應與其形狀保持一致，即未知樣品是球形分子就選擇球形分子作為標準品，未知樣品是線形分子就選擇線形分子作為標準品，這樣產(chǎn)生的誤差相對小一些。 3. 脫鹽及去除小分子雜質(zhì) 在生物大分子的分離純化時，常常用鹽析等方法獲取，因此樣品中含有大量的鹽或其他小分子。利用凝膠層析法脫鹽與用透析法脫鹽相比，它有快捷，不造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性等優(yōu)點。一般常用的是 Sephadex G25等排阻極限較小的凝膠類型。目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，但價格較貴。 4. 去熱源物質(zhì) 熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì) 。 它們是一類分子量很大的物質(zhì) ， 所以可以利用凝膠層析的排阻效應將這些大分子熱源物質(zhì)與其它相對分子量較小的物質(zhì)分開 。 一般在制備水解蛋白 、 核苷酸 、和酶注射液時 ， 常含有此類熱源物質(zhì) ， 凝膠層析是一種簡單而有效的去除方法 。 5. 溶液的濃縮 利用凝膠顆粒強烈的吸水性可以對大分子樣品溶液進行濃縮也是有效的。其作用基本類似于聚乙二醇的脫水作用，這種濃縮方法基本不改變?nèi)芤旱碾x子強度和 pH值。