【正文】 5. 溶液的濃縮 利用凝膠顆粒強烈的吸水性可以對大分子樣品溶液進行濃縮也是有效的。目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，但價格較貴。如果先前知道待測樣品的形狀，在選取標準品的時候，應(yīng)與其形狀保持一致，即未知樣品是球形分子就選擇球形分子作為標準品，未知樣品是線形分子就選擇線形分子作為標準品，這樣產(chǎn)生的誤差相對小一些。 2. 分子量測定 凝膠層析用于分子量的測定是一種常用的手段 。 1. 生物大分子的純化 凝膠層析的最主要應(yīng)用應(yīng)該就是對生物大分子進行純化。另外需要提的一點是，實驗時應(yīng)盡可能的參考相關(guān)實驗和文獻以及進行預(yù)實驗，以優(yōu)化最佳的實驗條件。一般凝膠的流速是 2－ 10 cm / hr。但影響洗脫速度的因素很多，例如柱子的長度、凝膠的型號、凝膠的粒度等。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據(jù)洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。 5. 加樣量 加樣量也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。 4. 洗脫液的選擇 凝膠層析所使用的洗脫液比較簡單，只是起運載工具的作用，不依賴于洗脫液性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，一般只使用一種緩沖液。 使用過的凝膠，若要短時間保存，一般是反復(fù)洗滌去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后加入適當?shù)目咕鷦?，例如：％的疊氮化鈉、 %~%三氯丁醇、%~%乙基汞硫代水楊酸鈉、%~%苯基汞代乙酸鹽、苯基汞代硝酸鹽或苯基汞代硼酸鹽等， 4 C下保存。為了除去凝膠顆粒中的氣泡，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法實現(xiàn)，否則會影響分離效果。如果加熱煮沸，則溶脹時間會大大縮短，一般在 1－ 5小時即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。 2. 凝膠的預(yù)處理 選擇好凝膠的類型和層析柱后 ， 根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度 ， 按下面的公式估算出凝膠的用量 。 選擇凝膠時，其次要選擇凝膠顆粒的粒度。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等，它們之間的相對分子質(zhì)量相差數(shù)十至數(shù)百倍，應(yīng)選用能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，一般交聯(lián)度較大的凝膠層析介質(zhì)分離效果好，比如，葡聚糖凝膠 Sephadex G25或聚丙烯酰胺凝膠 BioGel P6等。例如 Pharmacia Biotech的 Superdex（由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成）和Superrose（高交聯(lián)度多孔瓊脂糖珠）。最大缺點是吸附效應(yīng)較強（尤其是多孔硅膠），可能會吸附比較多的蛋白，但可以通過表面處理和選擇洗脫液來降低吸附。它們主要由 LKB提供的 Ultrol Gel AcA系列， AcA后面的數(shù)字分別表示聚丙烯酰胺和瓊脂糖的百分比濃度，例如 Ultrol Gel AcA34表示聚丙烯酰胺的百分比濃度是 3%，同時瓊脂糖的百分比濃度是 4%，數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，分級分離的范圍也就越小，反之亦然。 Sepharose與 1,3二溴異丙醇反應(yīng)，形成Sepharose CL型交聯(lián)凝膠，交聯(lián)前后的分離性能沒有改變，只是熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都有所提高，可以在更廣泛的 pH范圍內(nèi)應(yīng)用，穩(wěn)定工作的 pH范圍為 3－ 13。 瓊脂糖凝膠的穩(wěn)定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖是由 D－半乳糖和3,6－脫水半乳糖交替構(gòu)成的鏈狀多糖。聚丙烯酰胺凝膠對芳香族、酸性、堿性化合物稍有吸附作用，如使用離子強度略高的洗脫液操作，此弊病就可以克服。 聚丙烯酰胺凝膠的分級分離范圍、吸水率等性能，在水溶液、一般的有機溶液、鹽溶液中的穩(wěn)定性等基本近似于 Sephadex。 2. 聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺（ acrylamide，簡稱 Acr）為單體，甲叉雙丙烯酰胺（ N, N’methylene bisacrylamide，簡稱 Bis）為交聯(lián)劑，在過硫酸銨 TEMED（四甲基已二胺）或核黃素 TEMED催化劑的作用下交聯(lián)而成。 Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺（ N, N’methylene bisacrylamide）交聯(lián)而成。 另外， Sephadex G25和 G50中分別加入羥丙基基團反應(yīng)，形成 LH型烷基化葡聚糖凝膠。所以在用 Sephadex G進行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免 Sephadex G與蛋白發(fā)生吸附，但應(yīng)注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積發(fā)生較大的變化。強酸溶液和氧化劑會使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免 Sephadex G與強酸和氧化劑接觸。例如 Sephadex G50的排阻極限為 30,000，它表示分子量大于 30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。不同型號的 Sephadex G的吸水率不同，分級分離范圍也不同。 Sephadex G后面的數(shù)字除以 10表示該凝膠的吸水率（吸水率是指 1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，不包括顆粒間吸附的水份。 葡聚糖凝膠中最常見的是 Sephadex G系列，它是葡聚糖與 3－氯－ 1,2環(huán)氧丙烷（交聯(lián)劑）以醚鍵相互交聯(lián)而成。 1. 葡聚糖凝膠 葡聚糖凝膠是指由葡聚糖與交聯(lián)劑相互交聯(lián)而成的凝膠 。 凝膠的種類和性質(zhì) 凝膠的種類很多，但能用于凝膠層析的，應(yīng)具有這樣幾個特征：①惰性好，不能與待分離的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、吸附作用、離子交換作用或親和反應(yīng)等；②耐受性好，在高溫和有機溶劑的作用下，不發(fā)生變形；③剛性好，應(yīng)具有一定機械強度，能承受一定的操作壓力。凝膠層析的填料溶脹后是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球形惰性凝膠顆粒，顆粒的表面和內(nèi)部形成很多孔穴，且孔穴直徑較一致。目前主要用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥研究和生產(chǎn)中的蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化。 1959年， Porath和 Flodin首次將多孔聚合物－交聯(lián)葡聚糖凝膠作為柱填料，后來人們將凝膠制成球形微珠，作為分離介質(zhì)，獲得了巨大成功。 ⑺ 柱子的再生 柱層析的許多填料（吸附劑、離子交換樹脂或凝膠等）經(jīng)過適當方法的處理，又恢復(fù)其性能，可以反復(fù)使用多次，這就稱為柱子的再生。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進行鑒定。 ⑹ 收集 、 檢測 、 合并及保存 洗脫下來的流出液用部分收集器來收集。根據(jù)速率理論，我們知道流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。最常用的是濃度梯度，在水溶液中，亦即離子強度梯度。 如果被分離物質(zhì)的各組分在該溶劑和固定相中的分配系數(shù)較大 ，采用這種方法是適宜的 。② 加樣時應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊填料，以保持填料表面平坦。 對于分析性柱層析 ， 加樣體積不超過床體積的 1%。如果需要，可用蘭色葡聚糖 2022在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。最后在床面上鋪一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時擾亂床表面?？筛鶕?jù)不同的材料作相應(yīng)的溶脹、漂洗、再生、轉(zhuǎn)型、脫氣等。 ⑵ 裝柱 柱子填充質(zhì)量的好與差 ， 是關(guān)系到柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵 。 2. 柱層析的基本操作 柱層析的基本操作包括以下一些步驟： ⑴ 選柱 層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇 。 梯度混合器是有兩個彼此相通的圓筒容器和一個攪拌器組成的。 層析柱包括層析介質(zhì) 、 帶有篩板的玻管和各種接口 。 親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù) ， 具有很高分辨率 。 分配層析是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中 ， 不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達到分離目的的一種層析技術(shù) 。 氣相層析測定樣品時需要氣化 ，大大限制了其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用 ， 主要用于氨基酸 、 核酸 、 糖類 、 脂肪酸等小分子的分析鑒定 。 紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備 ， 通常為一次性使用 ， 而柱層析是常用的層析形式 ， 適用于樣品分析 、 分離 。 層析法的分類 層析根據(jù)不同的標準可以分為多種類型： 1. 根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類 ， 層析可以分為紙層析 、 薄層層析和柱層析 。 10. 內(nèi)水體積 （ Vi） 內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和 。