【正文】 9. 外水體積 （ Vo） 外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和 。 Vt是基質(zhì)的外水體積 （ Vo）和內(nèi)水體積 （ Vi） 以及自身體積 （ Vg） 的總和 。 一般以每克（ 或毫升 ） 基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克來表示 ， 數(shù)值越大 ， 表明基質(zhì)對該物質(zhì)的親合力越強；否則反之 。 一般來說 ， 正相色譜 （ 或正相柱 ）用于分離純化極性大的分子 （ 帶電離子等 ） 。 我們應(yīng)當根據(jù)實際情況綜合考慮 ， 特別是對于生物大分子 ， 我們還必須考慮它的穩(wěn)定性 ， 活性等問題 。 分辨率： 由上式可見， Rs值越大，兩種組分分離的越好。 很顯然 ， 差異越大 ， 分離效果越理想 。它可以小于等于 1， 也可以大于 1。 遷移率 （ 或比移值 ） 是指：在一定條件下 ， 某一組分在相同的時間內(nèi) ， 在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值 。 2. 流動相： 在層析過程中 ， 推動固定相上待分離的物質(zhì)向一定方向移動的液體 、 氣體或超臨界體等 ，都稱為流動相 。由于氣體分子的傳質(zhì)速度特別快，傳質(zhì)阻力對于氣相色譜和液相色譜的影響也是大相徑庭的，與分子擴散的影響相反，它對氣相色譜的影響可以忽略。分子擴散不僅與組分在氣相層析中停留的時間成正比，它還與載氣和組分的性質(zhì)、溫度液相色譜的影響、壓力和分子量等有關(guān)。因而，層析最好使用顆粒細、粒度均勻的填料作為固定相，以減少渦旋流擴散。 下面我們來討論一下這三方面因素的影響 。該理論吸收了層析的塔板理論的觀點 ， 同時又進一步把層析分離的分配過程與渦旋流擴散 、分子擴散及傳質(zhì)阻力三者的關(guān)系聯(lián)系起來 ， 提出了連續(xù)流塔板模型 。 它可以定量地描述層析柱的柱效率等 。 4. 流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程 （ 即不連續(xù)過程 ） 。 每層高度為 H， 稱為一個理論塔板 。在分離過程中組分要達到多少次平衡，進行了多少次分配，應(yīng)經(jīng)過多少個層（塔板）高。因此 , Martin和 Synge于 1952年被授予諾貝爾化學(xué)獎。 英國生物學(xué)家 Martin和 Synge根據(jù)塔板論，提出了遠見卓識的預(yù)言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高 (即增加了理論塔板數(shù) )，這將會大大提高分離效率。 后稱之為色譜 。層析技術(shù) 層析技術(shù)概述 引言 層析法亦稱層離法或色譜法（ Chromatography） ， 它從發(fā)明至今已有一個多世紀的歷史 。 由 chroma（ 色彩 ）和 graphs（ 圖譜 ） 構(gòu)成色譜一詞 ， 層析法由此而得名 。前者預(yù)見了氣相色譜的產(chǎn)生，并在 1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發(fā)性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革；后者預(yù)見了高效液相色譜（ HPLC）的產(chǎn)生，在60年代末也為人們所實現(xiàn)。 層析的兩個重要理論 層析法是一種利用混合物中各組分的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相中，即固定相和流動相，當流動相流過加有樣品的固定相時，各組分所受固定相的阻滯作用和受流動相的推動作用的影響各不相同，從而使各組分以不同速度移動而達到彼此分離的目的。理論塔板數(shù)量是衡量物質(zhì)在柱內(nèi)的分配次數(shù)，分離次數(shù)越多物質(zhì)的分離效果越好。 層析柱的長度用 L表示 。 5. 溶質(zhì)開始加在層析柱的第零塔板上 。 對層析技術(shù)的發(fā)展起了重要的推動作用 。 用 Van Deemter方程表示影響塔板高度的因素 。 渦旋流擴散（ A） 流動相中的組分由于受到固定相顆粒的阻礙，不得不從各種無規(guī)則的固體顆粒之間的間隙繞行，迫使其流動的方向不斷發(fā)生改變，稱為渦旋流擴散。 分子擴散（ B/u） 分子擴散是由濃度梯度所造成的。 傳質(zhì)阻力（ Cu） 在層析過程中，樣品各組分總是從流動相進入固定相，又從固定相進入流動相，如此反復(fù)多次，最終完成層析。若要減少液相層析的傳質(zhì)阻力，最好使用顆粒細，且微孔孔徑大的固定相。 柱層析中一般稱為洗脫劑 ， 薄層層析時稱為展層劑 。常用 Rf來表示 。 用 Rx來表示 。 4. 分辨率 （ 或分離度 ） 簡言之，分辨率是指相鄰兩個峰的分開程度，是用來判斷相鄰兩組分在層析柱內(nèi)的分離情況的，可以用兩個層析峰保留值之差與兩峰底寬的平均值之比表示。當 Rs 1時，兩峰總會有部分重疊；當 Rs = 1時，兩組分具有教好的分離，互相重疊約 2%，即每種組分的純度約為 98%；當 Rs=，兩組分完全能分開，每種組分的純度可達到 %。如 pH值 、 溫度等都會產(chǎn)生較大的影響 ，這是生化分離絕不能忽視的 。 反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性 ，在這種層析過程中 ， 極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出 。 應(yīng)當注意 ， 同一種基質(zhì)對不同種類分子的操作容量是不相同的 ， 其受到分子大小 （ 空間效應(yīng) ） 、 帶電荷的多少 、 溶劑的性質(zhì)等諸多因素的影響 。即 Vt= Vo + Vi + Vg。 外水體積 Vo可以通過測定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來測定 。 11. 基質(zhì)體積 （ Vg） 基質(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積 。 紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析 。 生物化學(xué)中常用的凝膠層析 、 離子交換層析 、 親和層析 、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式 。 而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式 ，適于生物樣品的分析 、 分離 。 凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相 ， 根據(jù)物質(zhì)的分子大小進行分離的一種層析技術(shù) 。 柱層析的基本裝置及基本操作 1. 柱層析的基本裝置 柱層析的設(shè)備主要有溶劑池 、 層析柱 、 恒流泵 、部分收集器 、 檢測儀和記錄儀 。 恒流泵用以保持一定的操作壓 ， 作為流動相的推動力 ，以便使樣品和洗脫液以一定的流速通過層析柱 。 如圖： 通過該裝置可以制造出線型梯度、凸型梯度、凹型梯度三種梯度形式。 一般來講 ， 層析柱的長度對分辨率影響較大 ， 長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長 ， 否則會引起柱子不均一 、 流速過慢等現(xiàn)象 。 一般要求填料在柱內(nèi)顆粒大小分布均勻 ， 松緊一致 ， 填料微孔中無氣泡 ， 不能分層 ， 連接處無死體積 ， 柱床體積穩(wěn)定 ， 在較高的工作壓力下不坍塌變形 、流速穩(wěn)定等 。例如，將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當濃度的酸（ ~1N）、堿 （ ~1N）、鹽（ ~1M）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)，用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈，然后再用酸堿處理得到所需的離子形式，最后再用去離子水（或蒸餾水）洗滌至中性。 ⑶ 平衡 柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強度）平衡柱子。 ⑷ 加樣 加樣量的多少直接影響分離的效果 。 上柱前 ， 應(yīng)先將樣品溶解在溶劑里或?qū)ο疵撘和肝?， 使樣品溶液的濃度盡可能高些 ， 以減少加樣體積 ， 使區(qū)帶狹窄 。 ③ 樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。 分步洗脫：對層析柱進行洗脫時 ， 當與柱子結(jié)合的一個組分被一種溶劑洗脫后 ， 更換溶劑洗脫下一個組分 ， 一種溶劑洗脫其中一種組分 。它的優(yōu)點之一是能夠減少拖尾現(xiàn)象。因此，為了獲得滿意的分離結(jié)果，溶劑的流速務(wù)必恰當控制。每管的收集量不能太多，一般 1ml5ml / 管。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進行鑒定。各種填料的再生方法是不同的，詳細操作可參閱操作手冊及有關(guān)文獻。 1964年，Moore又制備了具有不同孔徑的交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，能夠進行有機溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析（流動相為有機溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析）。同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。若樣品中各組分的分子大小不同，樣品進入凝膠層析柱后，各個組分向凝膠顆粒的孔穴內(nèi)擴散，能否進入孔穴內(nèi)部取決于孔穴的大小和組分分子的大小。常用的凝膠主要有葡聚糖凝膠（ dextran）、聚丙烯酰胺凝膠（ polyacrylamide）、瓊脂糖凝膠（ agarose）以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯(lián)物。 葡聚糖凝膠主要由 Pharmacia