【正文】 物安全防護水平（BSL4）。微量吸管5—1000ul。二、層析凝膠過濾法（分子篩層析法）主要用于蛋白或核酸分離。三、檢測儀 分光光度計及檢測物質(zhì)分光光度計波長nm比色皿檢測細菌濃度可見分光光度計600玻璃測定顏色可見分光光度計450檢測蛋白紫外分光光度計280石英檢測核酸紫外分光光度計260石英紫外透射儀：暗室紫外線下看DNA條帶。十二烷基硫酸鈉作用是解離蛋白，常用蛋白染料考馬斯亮藍，甘氨酸—緩沖瓊脂免疫電泳蛋白分離和鑒定脈沖電場凝膠電泳（PFGE）核酸分離用瓊脂糖作介質(zhì)。用水平電泳槽，充分分離DNA片段最佳范圍200bp50kb等電聚焦電泳（IFE）蛋白質(zhì)分離以兩性電解質(zhì)制造凝膠有不同PH，使帶不同電荷的多肽在電泳條件下于等電點停留。方法是以硝酸纖維素膜（NC膜）為載體，將試劑和標(biāo)本滴加在膜上，通過滲濾而逐步反應(yīng)，全程可于數(shù)分鐘內(nèi)完成，陽性在膜上呈紅色斑點。病毒的分子生物學(xué)鑒定：病毒核酸和蛋白質(zhì)測定?！?在酶切圖譜制作過程中,分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、瓊脂糖凝膠電泳。二、水分。㎏15分鐘?；罹嫈?shù)最準(zhǔn)確的方法傾注平板計數(shù)法。我國第一部實驗室生物安全國家標(biāo)準(zhǔn)是：《實驗室生物安全通用要求》。糖發(fā)酵試驗原理：多糖→單糖→丙酮酸→酸性產(chǎn)物（或產(chǎn)酸產(chǎn)氣）→PH下降→指示劑呈酸性變色。TIAg的特點: 非胸腺依靠性抗原,不需T細胞輔助即可刺激機體產(chǎn)生抗體。鑒定腸桿菌科基本條件；發(fā)酵葡萄糖、氧化酶陰性、還原硝酸鹽。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組一般不具感染性。DNA在合成中單核苷酸分子必須順序以共價鏈連接在已形成核酸鏈3’末端的羥基上。復(fù)制最主要的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅲ，該酶的核心聚合酶中，具有3’5’外切酶活性的亞基是e亞基。合成中tRNA搬運氨基酸作用、rRNA構(gòu)成核糖體骨架、mRNA直接決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。特點：游離抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物（IC），若IC不能被及時清除，即可在局部沉積，通過激活補體，并在血小板、中性粒細胞及其他細胞參與下，引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)而致組織損傷。免疫原性含義：剌激機體免疫系統(tǒng)，有誘生抗體和致敏淋巴細胞的能力。漿細胞來源于活化B細胞。鑒別宋內(nèi)志賀菌與其他志賀菌的生化反應(yīng)是：鳥氨酸試驗。急性期標(biāo)本接種于Vero細胞培養(yǎng)或藤鼠腹腔與小兒頑固性腹瀉有關(guān)的是：腸集聚粘附性大腸埃希氏菌引起旅游者腹瀉的最主要的是：腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌鉤體病的主要傳染源是：鼠類動物。MEM、RPMI 16403．細胞培養(yǎng)液分生長液、維持液，兩者區(qū)別在血清含量不同。（大小鼠、雌雄各半，初成年，受試后14天內(nèi)總死亡數(shù)）最小全數(shù)致死量（MLD）引起全部動物死亡的最小感染劑量。7．中和抗體抗病毒機制：改變病毒表面的構(gòu)型，阻止病毒吸咐、穿入易感細胞進行繁殖。包涵體病毒在增殖過程中使寄主細胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)，在光學(xué)顯微鏡下可見，多為圓形、卵圓形或不定形。12. 協(xié)同作用一種物質(zhì)的存在能促進其他物質(zhì)效應(yīng)的作用。17. Alsever液是一種紅細胞保存液，含有抗凝劑檸檬酸鈉和細胞需要的養(yǎng)分葡萄糖。19. 中和試驗必須制備高效價免疫血清或取高滴度病人恢復(fù)期血清。23. 鼻咽拭子的除菌處理：加抗生素終濃度20 000U/ml，4℃作用4小時，2000轉(zhuǎn)/ min，離心20分鐘。即以熒光素標(biāo)記抗體結(jié)合相應(yīng)細胞，用激光束激發(fā)單行流動的細胞，根據(jù)細胞所攜帶熒光(強度或類別)進行分選或分析。26. 病毒RNA的堿基序列與mRNA完全相同，稱為正鏈RNA病毒，這種病毒RNA可直接起病毒mRNA的作用。毒素基因位于大質(zhì)粒pXO1上，莢膜基因位于小質(zhì)粒pXO2上，二者是致病必須的。用1:1000的升汞固定5min。結(jié)核菌素試驗紅腫硬結(jié)：50IU/ml制劑，≤5㎜陰性，≥5㎜陽性；≥15㎜強陽性。結(jié)核病動物接種的鑒別診斷所接種的敏感動物豚鼠，腹股溝皮下。具有多形性、抗酸性、聚集性，典型胞內(nèi)菌。主要用涂片染色顯微鏡檢查，鼻黏膜或皮損處取材，用抗酸性染色后檢查。：菌體輕度彎曲似逗點狀，菌體一端或兩端有鞭毛，運動活潑，在暗視野鏡下觀察似飛蠅。內(nèi)毒素能侵襲小腸和大腸粘膜引起急性腸炎，致病因素：粘附、侵襲、產(chǎn)生毒素和分子模擬機制（并發(fā)癥一格林一巴利綜合征），產(chǎn)生細胞緊張性腸毒素、細胞毒素和細胞致死性膨脹毒素而致病臨床：腹痛、腹瀉、發(fā)熱，多見散發(fā)，是夏秋季腹瀉和旅行者腹瀉的主要病因之一。病原鑒定：氧化酶、過氧化酶陽性，G—呈S型、螺旋狀、紡錘形可初步確定為彎曲菌。熒光素是綠色熒光素（溶于水不溶于氯化）。在含1%蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露并加有Ⅹ和Ⅴ因子的酚紅肉湯培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗，是鑒別所有嗜血桿菌菌株的方法。病原鑒定方法： 標(biāo)本：腦脊液、血液、胸水?；钚蕴拷湍附鲆涵傊ê沽姿徼F、L半胱氨酸），菌落呈灰白色，如加溴甲酚紫，菌落呈淺綠色。并取3份，一份酸處理，一份熱處理50℃水30分鐘。是人呼吸道及腸道定殖菌，條件致病菌。動力和鳥氨酸脫羧酶陰性是本菌最大特點。三亞種區(qū)別：IMViC試驗：肺炎亞種――＋＋，臭鼻亞種－＋－d，鼻硬結(jié)亞種－＋――。專性細胞內(nèi)寄生。培養(yǎng)物中抑制劑二乙氨基葡聚糖。培養(yǎng)特性：動物接種是最常用的培養(yǎng)方法 ,采用豚鼠、小鼠可對多種病原性立克次體進行繁殖。常用姬姆尼次、姬姆薩染色，多形性，無芽無鞭。但恙蟲病立克次體的細胞壁結(jié)構(gòu)和抗原成分不同，無粘液層、無微莢膜、無肽聚糖和脂多糖，故另立為東方體屬。（一）普氏立克次體 () ：是流行性斑疹傷寒的病原體。嚙齒類動物、兔類、鳥類為傳染源。Giemsa染色呈淡紫色，Dienes染色呈藍色不易褪色。甲型（HAV）：正鏈小RNA病毒科，球形正十二面體，病毒顆粒無包膜，核酸RNA有感染性。乙型（HBV）：反轉(zhuǎn)錄病毒，嗜肝DNA病毒科，病毒顆粒3種：22nm小球形外膜顆粒、40—100nm 22nm管形顆粒、完整42nmDane顆粒。丙型（HCV）：黃科病毒，球型顆粒，1：1000甲醛液（福爾馬林）37度92小時可滅活。對各種滅活劑、脂溶劑敏感，耐干熱。糞—口傳播115. 人類免疫缺陷（HIV）：是獲得性免疫缺陷綜合征。HIV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，分HIVHIV2型，95%由HIV1造成，球形，由兩條單股正鏈RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶、核心蛋白質(zhì)組成。分離病原：在生物安全3級實驗室（BSL1）、生物安全柜內(nèi)進行，最敏感的分離技術(shù)是共培養(yǎng)，特征性細胞病變?yōu)槿诤霞毎?。HIV1 p24抗原陽性結(jié)果須中和試驗確認。按抗原分；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個血清型?；颊叱?4天就診，采5位0—4歲密切接觸糞便。病毒為螺旋對稱，有包膜，單股負鏈RNA不分節(jié)段，有6個結(jié)構(gòu)基因。抵抗力弱。IgG持續(xù)終身。F蛋白、H蛋白都是中和抗原118. 流行性出血熱：又稱腎綜合征出血熱HFRS。A549（人肺癌）傳代細胞、VeroE6（非洲綠猴腎）細胞、2BS（人胚肺二倍體）細胞、RL（大白鼠肺）細胞用于病毒分離。我國流行的是Ⅰ和Ⅱ型，伴三痛（頭，眼眶，腰）及紅（面，頸，上胸部）。病毒在胞內(nèi)繁殖，芽生釋放。用熒光免疫法病毒抗原積聚在細胞漿內(nèi)。病毒RNA在細胞漿內(nèi)直接起mRNA作用，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，在胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裝配成熟，出芽釋放。病毒分離：BHK、C6/36傳代細胞。4個血清型，分離細胞（C6/36株）。負鏈分節(jié)段RNA，3個基因節(jié)段：首選乳鼠腦內(nèi)、腹腔接種，取乳鼠腦組織制成抗體進行血清學(xué)交叉試驗。甲型流感病毒HA易發(fā)生點突變，導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生替換，造成抗原性漂?？贵w陽性應(yīng)兩種方法同時陽性來最終確認陽性結(jié)果。檢測抗體經(jīng)典法：血凝抑制試驗、補體結(jié)合試驗、中和試驗122．克里米亞—剛果出血熱CCHE：傳播媒介蜱，宿主蜂，又新疆出血熱。12登革熱DF：乙類，傳播媒介伊蚊，屬黃病毒科及屬，正鏈RNA，含有一條單一開放讀碼框架，3個結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E。最易感染的動物是出生2～3天的乳鼠，經(jīng)皮下接種，小鼠是常用的動物模型。屬黃病毒科，基因組長11 kb 單股正鏈RNA，球形，有包膜，根據(jù)E蛋白的核苷酸差異將乙腦分為5個基因組。病毒分離必須在生物安全4級實驗室進行。119. 埃博拉出血熱：傳染性十分強烈的出血性發(fā)熱性疾病。ELISA夾心法用于基層診斷和流行病學(xué)調(diào)查。鼠類為宿主和傳染源。在結(jié)構(gòu)基因中，H、N基因最易變異的基因。細胞分離：Vero細胞（非洲綠猴腎細胞）、原代外周血單核細胞（PBMC）、B95a細胞（EB病毒轉(zhuǎn)化的絨猴淋巴細胞），WHO推薦使用首選Vero/SLAM分離麻疹病毒；用ELISA方法檢測特異AgM抗體進行麻疹診斷。血凝素HA只能凝集猴紅細胞，并能與宿主細胞吸附；血溶素HL具有溶血和使細胞發(fā)生融合形成多核巨細胞的作用。WHO推薦用：人橫紋肌肉瘤細胞（RD）、轉(zhuǎn)人脊灰病毒受體的小鼠肺細胞（L20B）117. 麻疹病毒：以發(fā)熱、呼吸道卡他癥狀和全身丘疹為特征的急性傳染?。ū悾?。口服脊灰疫苗（OPV），脊灰Ig G≥1：100為陽性。確證試驗法：免疫印跡試驗（WB國常用）、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗（RIPA）、免疫熒光試驗（IFA）116. 脊髓灰質(zhì)炎病毒：小兒麻痹癥，糞—口傳播。報告定性結(jié)果時應(yīng)注明反應(yīng)條件、引物序列，報告定量結(jié)果時注明實驗方法、樣品種類及量。標(biāo)本：外周全血，抗凝劑：檸檬酸葡萄糖溶液B（ACD）用于新鮮抽提或凍存的血樣、肝素、CPD。感染后損傷免疫系統(tǒng)，引起致死性機會感染或腫瘤，乙類。戊型（HEV）：無包膜線狀單股正鏈RNA病毒球形，對高熱敏感。丁型（HDV）：衛(wèi)星病毒科，是一種缺陷病毒，需在（HBV）或嗜肝DNA病毒的輔助下才能復(fù)制增殖。Dane顆粒呈雙層外殼圓形顆粒，攜帶核心抗原（HBcsAg）,抵抗力很強，100℃10分鐘滅活。1：4000甲醛液（福爾馬林）37度71小時可滅活。16種支原體中，肺炎、解脲、人型、生殖器、發(fā)酵支原體對人致病，肺炎支原體引起間質(zhì)性肺炎，其它4種引起泌尿生殖道感染。采樣黏膜組織，～，在95%N2，5%CO2中生長好，菌落呈“油煎蛋”）樣菌落，取樣：黏膜組織。鼠、蚤傳播媒介，又稱鼠型斑疹傷寒。交叉凝集試驗稱外斐反應(yīng)（WeilFelix reaction），用于立克次體病的輔助診斷。雄性豚鼠腹腔接種，,觀察陰囊紅腫（流—，地+）抗原結(jié)構(gòu)：一、可溶性群特異性抗原，與細胞壁表層的脂多糖構(gòu)成，耐熱。目前常用的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)有雞胚成纖維細胞、L929細胞、Vero細胞,用PCR方法進行鑒定。人畜共患，立克次體的致病物質(zhì)主要有內(nèi)毒素（脂多糖）和磷脂酶 A。衣原體的兩種形態(tài)：原生小體（EB，小而致密的顆粒結(jié)構(gòu)，具感染性，姬染紫紅色，無繁殖力）。有獨特發(fā)育周期，能通過細菌濾器。利用莢膜腫脹試驗分型，3型和12型，magA基因作該菌診斷。有些菌株還可產(chǎn)生LT和ST腸毒素。感染臨床主要有2種形式：軍團菌病LD（肺炎型）龐提阿克熱PF109. 克雷伯桿菌：又稱肺炎桿菌，以肺炎克雷伯菌多見，G—有較厚莢膜，多數(shù)有菌毛，無芽孢和鞭毛，菌體呈卵圓形或球桿狀成雙排列，有時菌落出現(xiàn)黏液型用接種環(huán)可成絲。試管凝集法抗體的陽性標(biāo)準(zhǔn)：1≥320水是人類感染的主要來源，水樣1L，樣本采集到濃縮培養(yǎng)最長不超過14天，最好不超過2天。無芽胞、無莢膜、有鞭毛，需氧菌（5%CO2剌激生長）常規(guī)不易著色，最適為36℃，初次分離要L半胱氨酸，含鐵鹽可促進生長，主要可用活性碳－酵母浸出液平板（BCYE），不分解糖。副流感嗜血桿菌生長只要Ⅴ因子。107. 流感嗜血桿菌：寄生人體鼻咽部，抵抗力弱，嬰幼兒易感，G—球桿菌，用石碳酸復(fù)或美藍單染呈現(xiàn)兩端濃染。多引物一步PCR擴增法空腸彎曲菌mapA基因特異彩片段等。標(biāo)本采0—5日內(nèi)用藥前，于運送培養(yǎng)基中4小時內(nèi)檢。微需氧菌，～5%氧和10%CO2的環(huán)境中生長最好。一般瘤型和界線類患者標(biāo)本中可找到細菌在細胞內(nèi)存在，有診斷意義。免疫功能決定了感染后是否發(fā)病及臨床類型。蠟質(zhì)D為細胞壁主要成份，是一種肽糖脂與分枝菌酸復(fù)合物，能引起遲發(fā)性過敏反應(yīng)，并具有佐劑作用。結(jié)核病的診斷依據(jù)：臨床表現(xiàn)、X線檢查特征的肺結(jié)核表現(xiàn)、結(jié)核菌的痰涂片檢查、以及結(jié)核菌素試驗為主要手段的免疫測試。103. 結(jié)核分枝桿菌：人型和牛型，專性需氧，曾發(fā)現(xiàn)G＋非抗酸顆粒稱Much顆粒，無芽無鞭無莢，燭缸法不適，應(yīng)用二氧化碳培養(yǎng)皿，常用羅－琴或米氏7H10培養(yǎng)基，35～40℃可長，35～37最適，～，18h分裂一代，2～6周才能長出菌落，不發(fā)酵糖類，人型的煙酸，硝酸鹽還原，煙酰胺酶試驗均陽性。鏡檢：革蘭、莢膜染色。27. 蠟樣桿菌能耐受100℃30min。用以分析細胞大小、細胞周期、DNA含量、細胞表面分子以及進行細胞分選等。將含病毒的懸液20006000轉(zhuǎn)/ min，離心3040分鐘，可除去90%以上的細胞碎片和雜質(zhì)。21. 乙腦病毒主要存在于血清中，用一于分離病的血清一般不加抗凝劑。18. 常用的細胞培養(yǎng)液：MEM、1640。14. 空斑試驗用于測定病毒的感染力。10. C6/36是白蚊伊蚊細胞：分離登革熱、乙腦病毒。潛伏期很長可達數(shù)月、數(shù)年或數(shù)十年之久。TCID50—半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量。4．細胞病變（CPE）、二甲亞砜（DMSO）細胞保護劑、5．半數(shù)致死量（LD50）導(dǎo)致半數(shù)動物死亡的細菌感染量。病毒檢驗基本技術(shù)1．組織培養(yǎng)用玻璃器皿：硫酸、重鉻酸鉀液浸泡。在CFT反應(yīng)中為了查Ag，常常降低反應(yīng)溫度，稱為冷CFT，冷CFT反應(yīng)溫度通常是：4℃目前已知的可以在臨床上造成出血熱的病毒如下：布尼亞病毒科：流行性血熱、克里米亞剛果出血熱黃病毒科：登革出血熱絲狀病毒科：艾博拉出血熱?？梢员３值鞍踪|(zhì)活性的蛋白質(zhì)沉淀方法是：硫酸銨、聚乙二醇、免疫沉淀法。免疫球蛋白（Ig）的分類主要依據(jù)—重鏈恒定部份