【正文】 PolyA+mRNA，分離后的 mRNA 可以用洗脫液或加熱的方法解離下來。已經(jīng)應(yīng)用于巨細(xì)胞病毒、沙眼衣原體、惡性瘧原蟲、 HIVl 型病毒，人類基因等。 Hultman 等描述了一種運(yùn)用磁性分離技術(shù)的體外誘變方法。過程一般是將免疫磁珠與樣品混合，培養(yǎng) l0min~30min，外加磁場提取結(jié)合 244 有活微生物的磁珠。 Cudjoe 等首先用免疫磁珠分離出培養(yǎng)基和臨床樣品中的毒素， 然后在免疫磁珠上直接用 ELISA（ IMBELISA）進(jìn)行檢測，他建立了用 IMB隊(duì) ISA 檢測食物中的沙門氏桿菌的系統(tǒng)，對于熱處理后的熟食品，增菌后的培養(yǎng)基中僅含微量競爭性腸道菌群，濃縮后可直接用 IMBPCR 進(jìn)行檢測；對于未經(jīng)過熱加工的生食品，其中含有較多的競爭微生物，要先用免疫磁珠進(jìn)行分離，然后在 M培養(yǎng)基中短時(shí)增菌，濃縮，最后用 IMBELISA 檢測。 Ben 等則對用 IMBELISA 分離檢測食品中的大腸桿菌 O157 進(jìn)行了評價(jià)。在將樣品中的細(xì)菌濃集至合適體積的同時(shí)也除掉了非特異的 Taq 酶抑制因子。 Grindede 等則將免疫磁珠和反轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR)結(jié)合起來用以檢測環(huán)境樣品中的 A 型反轉(zhuǎn)錄病毒。 最近，市場上出現(xiàn)了一種將免疫磁珠和電化學(xué)發(fā)光傳感器（ IMBECL）結(jié)合起來的自動(dòng)檢測系統(tǒng) ORIGEN，首先用免疫磁珠捕獲靶物質(zhì)，再用夾心的方法聯(lián)上釕的三（二吡啶）螯和物 [Ru(bpy) 3]2+標(biāo)記的 reporter 抗體，用磁場濃集后用電壓激發(fā)出電化學(xué)發(fā)光。最近，朋 MT 用于小細(xì)胞肺癌、睪丸癌和乳腺癌也取得了令人鼓舞的結(jié)果。其中，運(yùn)用免疫磁性微球物理 地清除癌細(xì)胞的方法具有安全、效果好、操作簡便的特點(diǎn)，得到廣泛應(yīng)用。如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等 [33]。然后加入預(yù)先和羊抗鼠免疫球蛋白培養(yǎng)過的磁性微球。而對正常細(xì)胞的損害極小，通過分離裝置后，細(xì)胞的活性超過了 98％。微球與靶細(xì)胞比例為 50:1。實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用免疫磁性微球在自身骨髓移植前清除癌細(xì)胞是一種安全、簡單、可重復(fù)的技術(shù)。病人表現(xiàn)出嚴(yán)重的 T 細(xì)胞缺陷，在移植后一年內(nèi)不能檢測出 IL2 的分泌，但 NK 細(xì)胞的功能在移植后一個(gè)月正常，在第二和第三個(gè)月甚至超出一般水平。免疫磁性處理過程為自身骨髓與連接在磁性微球上的一組單抗一起培養(yǎng)。其中二人的無病存活期超過了先前的緩解期（ 20 月和 12 月）。單核細(xì)胞與 CFUGH 在免疫磁性凈化后的恢復(fù)率分別為 40％和 45％，在 Maphosphamide 凈化后恢復(fù)率分別為 84％和 5％。 Shpall、 Anderson 等人將 IMMS應(yīng)用于乳腺癌病人的自身骨髓移植，對應(yīng)用 IMMS 清除乳腺癌的最優(yōu)條件進(jìn)行了探討。 免疫磁性微球用于骨髓中癌細(xì)胞的清除也有一些缺點(diǎn)，主要是在方法學(xué)、靶細(xì)胞種類、檢測方法的靈敏度等方面變異性較大，但仍不失為一種安全、簡便、有效的方法。 Champlin 等用免疫磁珠在異體骨髓移植前只清除其中的 CD8+細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)既可以防止 GVHD，又保留了移植物抗白血病的能力?？梢垣@得不到 2％的細(xì)胞，但其中保留了所有原先存在的造血干細(xì)胞。 (3) 組織分型 器官移植中的 HLAl 和 HLA2 組織分型一般采用微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，首先要采用密度離心法將細(xì)胞從外周血中分離出來，步驟煩瑣費(fèi)時(shí)。在磁珠上連接抗人多態(tài)型 HLA 決定族，通過評價(jià)細(xì)胞和磁珠之間形成花環(huán)的程度來直接進(jìn)行分型。 Brinchmann同時(shí)應(yīng)用免疫磁珠成功地從自然感染的 CD4+細(xì)胞中分離出了人類免疫缺陷病毒 (HIV)，并發(fā)現(xiàn)活化的 CD8+細(xì)胞對自然感染的 CD4+細(xì)胞中的 HIV 的復(fù)制有抑制作用，表明 CD84+細(xì)胞可以分泌一種可溶性的 HIV 復(fù)制抑制因子。這項(xiàng)技術(shù)可以用來生產(chǎn)人單克隆抗體。 (5) 分離細(xì)胞器 [34] 傳統(tǒng)上，分離細(xì)胞器都是基于細(xì)胞器大小和密度的差異，在細(xì)胞勻漿后應(yīng)用密度梯度離心來實(shí)現(xiàn)的。應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)則可避免這類缺陷。 EMBL 用一對簡單的抗原 /抗體模型對 MFFS 的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，它相對于傳統(tǒng)的分離方法具有收率高、非特異吸附少、對結(jié)合物損傷小等優(yōu)點(diǎn)。 Ohashi 等則用免疫磁珠進(jìn)行了分離頂體反應(yīng)精于的嘗試。可以重復(fù)地檢測出樣品中小于 10pg 的 DNA（ l cell）。 KaplanMeier 分析表明血液中 Kras 突變細(xì)胞的檢測結(jié)果與無病存活期顯著相關(guān)（ p）。據(jù)報(bào)道 RNA 包入脂質(zhì)體內(nèi)的包封率可達(dá) 43%~60%。 磁性納米粒的其它應(yīng)用 磁性納米粒也可以用來固定化酶，例如已知大腸桿菌天冬酰胺酶對急性淋巴白血病有明顯療效，注射入體內(nèi)后，可迅速清除血清中的天冬酰胺 — 敏感性腫瘤細(xì)胞的必需營養(yǎng)成分。磁性納米粒還是目前國內(nèi)外高分子材料研究領(lǐng)域的熱門方向之一。 參考文獻(xiàn) 1 Gregoriadis G, Senior J, Trouet A. 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Life Sciences, 1996, 158(24): 2251~2261 10 Margel S, Kreuter J. Polyacrolein microspheres as a new tool in 。理論上，理想的磁性藥物載體應(yīng)該具備以下幾個(gè)條件：具有較好的磁場響應(yīng)性，在靶部位置外磁場后，載體能夠 100%地滯留在靶部位；粒徑足夠小能夠自由通過最小內(nèi)徑的毛細(xì)血管，不會(huì)發(fā)生異位栓塞和滯留；不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和其它正常細(xì)胞攝取或吞噬；藥物載體具有較高的載藥能力，并可以 進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，并達(dá)到藥物的控釋。徐慧顯等 [36]用葡聚糖磁性納米粒作為天冬酰胺酶的載體，使固定化天冬酰胺酶在制備過程中可用磁場分離；并能像自由酶那樣腹膜注射；有可能延長其載體循環(huán)中的半衰期。并且與陰離子脂質(zhì)體、 pH 敏感脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、融合脂質(zhì)體相比，陽離子脂質(zhì)體在基因治療中具有穩(wěn)定性好，貯存時(shí)間較長，轉(zhuǎn)染率較高以及能夠轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)雜的大分子物質(zhì)的特點(diǎn)等。 248 磁性脂質(zhì)體作為基因輸送的載體 隨著人類基因組計(jì)劃的初步完成，基因治療漸漸走進(jìn)了臨床應(yīng)用，使得基因的輸送變成了無法回避的問題。 9 例發(fā)現(xiàn)有癌細(xì)胞的病人中， 7 人因?yàn)閺?fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡。 Hardingham 等發(fā)展了用 IMBPCR 來檢測血液中癌細(xì)胞的技術(shù)。 (6) 用免疫磁珠清除自身免疫型精子 Foresta、 Shulmand 等應(yīng)用免疫磁性微球來清除自身免疫不育病患者精液中帶有自身抗體的精子，希望用凈化的精于 進(jìn)行體外或體內(nèi)受精來治療自身免疫不育癥。調(diào)節(jié)磁場至一個(gè)合適的強(qiáng)度，使洗滌液自由流下的同時(shí)磁珠及其吸附物維持于瓶中。另外，許多新發(fā)展起來的細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)必須用體外培養(yǎng)的細(xì)胞。 Ossendorp 等用聯(lián)有 Thyroglobulin 的免疫磁珠來與 B 細(xì)胞雜交瘤系形成花環(huán)， Throglobulin 特異細(xì)胞濃集了 300 倍。獲得了l04~l06 倍富集的特異性 B 細(xì)胞。 Brinchmann 等設(shè)計(jì)了一種快速、 247 直接從血中定量各個(gè)淋巴細(xì)胞亞類絕對數(shù)目的方法。 Lie 等發(fā)現(xiàn)用此方法也可進(jìn)行血清的 BoLA 分型，并且明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。如 Smeland 等采用直接聯(lián)有抗 CD34+細(xì)胞的單克隆抗體的免疫磁珠來分離干細(xì)胞，分離后用抗 Fab 段血清將磁珠從細(xì)胞上洗脫下來，用此方法可以獲得 40%~70％的 CD34+細(xì)胞，純度可達(dá) 95％以上。 (2) 反相分離干細(xì)胞 直接移植骨髓干細(xì)胞是克服異體骨髓移植時(shí) GVHD 和 ABMT 時(shí)癌癥復(fù)發(fā)的一種可能的選擇，但最大的困難是如何分離出純的造血干細(xì)胞。 Vartdal 等對直接 T 細(xì)胞清除法作了改進(jìn)，磁珠 首先與羊抗鼠 IgG 相聯(lián)，然后再與抗 CD2 和 CD3 的單克隆抗體結(jié)合。 Anderson 等人聯(lián)合應(yīng)用免疫磁性微球 和化學(xué)分離法從正常骨髓中清除 CAMAl 乳腺癌細(xì)胞。 246 Gruhn、 Trickettti 等人也對 IMMS 在急性淋巴細(xì)胞 性白血病中的應(yīng)用進(jìn)行了探討。其中 ll 例應(yīng)用 IMMS 進(jìn)行骨髓凈化，3l 例用 Maphosphamide 進(jìn)行骨髓凈化， 14 例沒有進(jìn)行骨髓凈化。自身骨髓移植后，在 3 例病人中都能觀測到血相重建。 Ogniben 等人對 IMMS 在 NHL 病人自身骨髓移植中的應(yīng)用也作了研究。能夠可重現(xiàn)地清除 3~4 個(gè)對數(shù)級的惡性細(xì)胞，此結(jié)果與應(yīng)用 Burkitt 淋巴瘤的補(bǔ)體溶 解方法所得類似。兩例病人移植順利并無并發(fā)癥。 (2) 用于清除淋巴瘤細(xì)胞 De Rosa 等人將 IMMS 應(yīng)用于 2 例淋巴瘤病人的自身骨髓移植。則神經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞被滯留，“干凈”的骨髓自然流下。 1984 年， Treleaven 等人建立了運(yùn)用 IMMS 從骨髓中清除癌細(xì)胞的模型系統(tǒng)。而 IMMS 凈化骨髓不需要特異的 ISOTYPE 抗體，也不受正常骨髓中抗補(bǔ)體因子的影響，可以清除低水平抗 245 原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。因此，在體外清除骨髓中的癌細(xì)胞是保證 ABMT 成功的必要條件。分析碳疽桿菌芽孢時(shí)，可檢測到 l00 個(gè)芽孢。運(yùn)用這種技術(shù)可以省略去通常為排除背景干擾所要 進(jìn)行的電泳、內(nèi)切酶譜、雜交等步驟。另外，凍存過的樣品中可能包含死菌，不適合 培養(yǎng)，而應(yīng)用 PCR 則可以很好地進(jìn)行檢測。影響 PCR 直接應(yīng)用于臨床診斷的一個(gè)因素是樣品，如糞便和血液中的某些成分會(huì)影響 Taq 酶的靈敏度。最低檢測限可達(dá) l05/mL 樣品。免疫磁 珠技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)：將靶細(xì)菌從環(huán)境中分離出來，從很大的體積濃集至適于培養(yǎng)的體積；將樣品中的生長抑制因子從細(xì)菌中清除去，有利于細(xì)菌的生長；當(dāng)樣品中既有病原菌，又有大量非致病性變種時(shí)，選擇性培養(yǎng)基在分離靶生物時(shí)經(jīng)常無能為力，而免疫磁珠在選擇性分離擁有與致病力有關(guān)的特異抗原決定族的菌種方面具有很大的潛力。另外，磁珠還用于單鏈 DNA 探針的標(biāo)記和 genomic Walking 等。用此方法從人染色體克隆人類阿樸脂蛋白 E 基因片斷，可以獲得 90％以上的正確重組體。 (3) DNA 序列分析 將親和磁珠和 PCR 結(jié)合起來可以進(jìn)行 DNA 測序。 (1) 純化 DNA 結(jié)合蛋白 連接有特異核苷酸序列的親和磁珠與樣品反應(yīng)，提取出結(jié)合蛋白，再加入高鹽溶液就可以將純化蛋白洗脫下來，磁珠可以反復(fù)使用。親和素一生物素之間的結(jié)合力非常強(qiáng)（ Kd＝ l015），有利于操作。 FACS 價(jià)格昂貴，技術(shù)復(fù)雜，經(jīng)常會(huì)被所分選細(xì)胞的容量、活性、無菌度等問題所困擾；紅細(xì)胞花 環(huán)技術(shù)無法處理大量的細(xì)胞，另外，至今尚無一成熟、簡便的方法能夠?qū)⒖贵w偶聯(lián)至紅細(xì)胞膜上； Panning 技術(shù)也有很多局限性，它難于放大操作，步驟煩瑣，不能定量，靶細(xì)胞經(jīng)?；祀s著非特異吸附在培養(yǎng)板底部的其它細(xì)胞。但要經(jīng)過多次的洗滌步驟，特異性也會(huì)有所降低。間接法是指先將細(xì)胞與特異抗體混合培養(yǎng)，使特異抗體結(jié)合在細(xì)胞表面，然后加入預(yù)先用抗鼠IgG（二抗）處理的磁性微球。由于它能特異性地與靶物質(zhì)結(jié)合并使之具有磁響應(yīng)性，因此將免疫磁性微球與含有靶物質(zhì)（欲分離的物質(zhì)）的復(fù)雜混合物共同培養(yǎng)，則免疫磁性微球可以通過抗原抗體反應(yīng)選擇性地與靶物質(zhì)結(jié)合，當(dāng)此混合物通過一個(gè)磁場裝置時(shí)，與免疫磁性微球結(jié)合的靶物質(zhì)就會(huì)被磁場滯留，從而與其它復(fù)雜 物質(zhì)分離開來。 另外，用磁性納米粒制備的免疫磁性微球 在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用也非常廣泛，而且發(fā)展較快，國外已有產(chǎn)品上市。其中磁性脂質(zhì)體較早地應(yīng)用