【正文】 es）即多室脂質(zhì)體等等。 陽(yáng)離子脂質(zhì)體 1．陽(yáng)離子脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)形式 陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由一種陽(yáng)離子親水脂分子和二油酰基磷脂酰乙醇胺（ DOPE）組成， DOPE 作為“脂質(zhì)伴侶”是形成穩(wěn)定的單脂雙層陽(yáng)離子脂質(zhì)體所必需的。脂質(zhì)衍生物主要是由磷脂酰乙醇胺、膽固醇、二?；视偷韧ㄟ^一個(gè)可降解的酯鏈接上一個(gè)陽(yáng)離子基團(tuán)而形成，帶正電。含胺類基團(tuán)的極性頭部起著脂質(zhì)體與 DNA、脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)其它組分相互結(jié)合的作用；隔離區(qū)的鏈長(zhǎng)和鍵長(zhǎng)則影響陽(yáng)離子脂質(zhì)體與粘膜表面的相互作用，進(jìn)一步影響轉(zhuǎn)染效率；連接鍵決定了陽(yáng)離子脂質(zhì)體的化學(xué)和生物穩(wěn)定性，一般要求陽(yáng)離子脂質(zhì)體既有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，又易在體內(nèi)被生物降解、減少細(xì)胞毒性?；蛑委煟?Gene therapy）是指將遺傳物質(zhì)（即 DNA）轉(zhuǎn)入人體細(xì)胞，并整合至染色體中，取代突變基因，補(bǔ)充缺失基因或關(guān)閉異?；?，從而達(dá)到治療機(jī)體疾病或有益于治療的目的。但眾多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用病毒載體和脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是最有前途的方法，后者已被美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)批準(zhǔn)為臨床基因治療的第一方案。 許多陽(yáng)離子脂質(zhì)體，特別是由單價(jià)脂質(zhì)組成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，無法濃縮 DNA，從而導(dǎo)致脂質(zhì) DNA復(fù)合物異質(zhì)分布，影響脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率 。同 PLL 相比，硫酸魚精蛋白的分子量?。?MW=4000； PLL 的 MW=18500）；分子中含有 21 個(gè)精氨酸殘基，帶有很強(qiáng)的正電荷；硫酸魚精蛋白是一種天然蛋白， FDA 批準(zhǔn)其作為肝素 誘導(dǎo)抗凝血作用的解毒劑。 首先，陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電的基因通過靜電作用形成脂質(zhì)體 基因復(fù)合物，此復(fù)合物因陽(yáng)離子脂質(zhì)體的過剩 而帶正電；帶正電的脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物由于靜電作用吸附于帶負(fù)電的細(xì)胞表面，然后 185 通過與細(xì)胞膜融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞。 (1) 陽(yáng)離子脂質(zhì)體與基因形成復(fù)合物 質(zhì)粒 DNA 可以被包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，或者與脂質(zhì)體表面借靜電作用形成復(fù)合物。它能被某些因素所誘發(fā)，如一些脂質(zhì)、肽類或 pH 值變化?，F(xiàn)已證明在六方晶相脂質(zhì)的頭部，基因呈高度彎曲的形狀。從 Lα 到 HH 相轉(zhuǎn)變過程中，脂質(zhì)最有利的分子構(gòu)型是錐狀，如小的極性頭和大的疏水烴鏈，而圓柱狀的脂質(zhì)有利于形成層狀構(gòu)型，細(xì)胞融合 吞飲作用 DNA 放釋放 溶酶體 核內(nèi)體 細(xì)胞融合 吞飲作用 核內(nèi)體 溶酶體 DNA 釋 放 轉(zhuǎn)錄 核攝取 核內(nèi)體 翻譯 陽(yáng)離子脂質(zhì)體 復(fù)合物 蛋白質(zhì) 圖 65 陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移基因圖 186 反錐狀的脂質(zhì)（大的極性頭部和小的疏水鏈）則形成膠束結(jié)構(gòu)。這也是 DOPE 成為“脂質(zhì)伴侶”的原因。 （ 2） 陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物與細(xì)胞外物質(zhì)的相互作用 當(dāng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物進(jìn)入體內(nèi)后，它將同細(xì)胞外的一些物質(zhì)發(fā)生相互作用。盡管在血流中確實(shí)發(fā) 生脂質(zhì)復(fù)合物的聚集，但由于聚集體的直徑通常在 lμ m 以下，比正常的紅細(xì)胞體積還小，因此很可能通過細(xì)胞內(nèi)吞作用而被攝取，內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的針對(duì)變性白蛋白的受體可能參與這一過程。目前認(rèn)為陽(yáng)離子脂質(zhì) 體 DNA 復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞有三種模式： (1)與細(xì)胞表面發(fā)生非特異性結(jié)合； (2)通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入，隨后與核內(nèi)體膜發(fā)生融合； (3)通過細(xì)胞質(zhì)膜上形成的小孔進(jìn)入。在 DNA 從核內(nèi)體的脫離過程中，脂質(zhì)的融合起到十分重要的作用。在胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞通過微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或肌動(dòng)蛋白微絲等主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將含 DNA的微粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至核周圍。 Xu 等 [46]認(rèn)為質(zhì)粒 DNA從陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物的釋放發(fā)生于復(fù)合物與核內(nèi)體融合的時(shí)候；但也有人認(rèn)為，陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物從核內(nèi)體中脫離出來時(shí)并未分解，質(zhì)粒 DNA 從復(fù)合物的釋放應(yīng)發(fā)生在此后的階段。 3．聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體（ PCL） [47] 同陽(yáng)離子脂質(zhì)體相比，聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以更有效地將陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，且細(xì)胞毒性和溶血活性小。 ） mV, 而 PC 為（ 177。因此，必須開發(fā)新型的具有特異靶向性的載體系統(tǒng) [48]。 肝細(xì)胞唾液酸糖蛋白缺乏受體、巨噬細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的甘露糖受體特別適合于脂質(zhì)體介導(dǎo)的特異性基因轉(zhuǎn)移。 糖基化脂質(zhì)體的制備可以采用脂蛋白包衣或者是將糖脂融合到脂質(zhì)體的表面，糖脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量和理化性質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響很大。圖 66 [52]進(jìn)一步說明了不同類型的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合 物小鼠靜脈注射后在組織中的靶向性及其轉(zhuǎn)染效率。雖然可以預(yù)先用空白脂質(zhì)體或硫酸葡聚糖等巨噬細(xì)胞抑制劑抑制 巨噬細(xì)胞的吞噬作用，從而降低肝臟對(duì)脂質(zhì)體的攝取，但這對(duì)機(jī)體防御功能不利。這種快速而有效的清除包括兩個(gè)過程：首先，血漿成分（如血漿蛋白、脂蛋白、纖維蛋白、免疫蛋白、補(bǔ)體 C 等）包裹粒子而使之可被吞噬細(xì)胞識(shí)別即調(diào)理過程。吞噬過程很復(fù)雜，至少包括兩個(gè)階段，即激發(fā)階段和胞飲階段。盡管其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但它們有一個(gè)共同點(diǎn)，即在脂質(zhì)體表面能形成一個(gè)親水的伸展 的分子拉鏈?？墒窃摲肿永湵旧砭哂猩砘钚裕ㄈ缱R(shí)別糖脂，和天然凝集素鍵合等），從而影響脂質(zhì)體的生物功能。很明顯，脂質(zhì)體表面被糖脂或不同聚合物修飾后，生物分子與脂質(zhì)體的碰撞速率降低，可用公式來表示： F= P0PP / P0， F 為立體因子，與濃 度無關(guān)； PP 和 P0 分別表示長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體和脂質(zhì)體的碰撞幾率。實(shí)驗(yàn)證明，含5％ ~15％摩爾 GM1 的脂質(zhì)體血中滯留量明顯增高，半衰期大大延長(zhǎng)。長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體目前主要有剛性脂質(zhì)體，表面修飾脂質(zhì)體和其它類型，這類脂質(zhì)體可能是因?yàn)槟承┠茏晕易R(shí)別的分子與脂質(zhì)體結(jié)合后，能起到保護(hù)脂質(zhì)體不被 RES 識(shí)別的作用（見圖 68[54]）。在長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體研究中，聚乙二醇化 (PEGs)脂質(zhì)體的長(zhǎng)循環(huán)機(jī)制之一即是立體位阻效應(yīng)。某些帶正電荷粒子可在被肝攝取后重新分配到脾而不是肝。 （ 5）特異性配體的缺乏 機(jī)體對(duì)外來異 物作用時(shí)，除非特異性吞噬作用外，還存在特異性的受體 (包括免疫球蛋白、補(bǔ)體等 )介導(dǎo)的過程。 研究表明，用 PEG 及非離子表面活性劑包衣的脂質(zhì)體被肝、脾攝取減少，脂質(zhì)體在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)。高表面密度和長(zhǎng)的 PEG 鏈對(duì)降低蛋白質(zhì)對(duì)脂質(zhì)體的吸附是必要的，表面密度在空間位阻和范德華力上的影響比鏈的長(zhǎng)度影響更大。國(guó)外學(xué)者提出的固體對(duì)蛋白質(zhì)排斥理論模型，對(duì)空間位阻、范德華力和親水作用都進(jìn)行了廣泛而深入的研究。 4． 研究現(xiàn)狀 （ 1） 高分子 表面修飾的脂質(zhì)體 [55] 常用的高分子有聚乙二醇（ PEG）、混合磷脂、非離子表面活性劑、 IgA 及血清成分等，其主要目的是提高脂質(zhì)體表面的親水性，降低脂質(zhì)體與調(diào)理素間的相互作用。粒徑的大小可以用于控制微粒制劑的靶向性，同時(shí)粒徑大小也能影響對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)循環(huán)表面修飾的程度。 191 （ 3）調(diào)整ζ電位 一般來講，極性微粒不易被吞噬，ζ電位 越高，被吞噬越少。血漿中成分（例如調(diào)理素）更易于與疏水性表面結(jié)合， 調(diào)理作用可產(chǎn)生疏水性更強(qiáng)的表面，疏水性很強(qiáng)的粒子不需要被調(diào)理就可以被吞噬，因而提高表面親水性可以抑制調(diào)理作用。有人將神經(jīng)節(jié)苷酯摻入二硬脂酸胞苷，所制備的脂質(zhì)體在磷酸緩沖液和血漿中 24 小時(shí)后僅釋放包封藥物的25％。 3．實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)的途徑 最初研究長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體主要是從生物學(xué)角度考慮，制備血循環(huán)中長(zhǎng)壽命的脂質(zhì)體。 分子拉鏈的保護(hù)機(jī)理可以用化學(xué)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)來解釋。 RP：識(shí)別蛋白； k1：脂質(zhì)體與 RP1結(jié)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。然而整個(gè)吞噬過程同酶催化反應(yīng)相似。該動(dòng)力學(xué)過程可以用經(jīng)典的化學(xué)反應(yīng)來描述（圖 67[53]）。所謂長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體就是靜脈注射給藥后，能夠躲避 RES 的攝取而在血液循環(huán)系統(tǒng)中長(zhǎng)時(shí)間滯留，進(jìn)而可到達(dá)非 RES 系統(tǒng)的靶向載藥系統(tǒng)。載藥脂質(zhì)體進(jìn)入血管后，靶向作用于 RES 系統(tǒng)，這對(duì)于治療 RES 系統(tǒng)疾?。ㄈ鐑?nèi)臟利什曼病、細(xì)胞內(nèi)感染）有特殊的意義。 GalC4chol/DCchol/DOPE(2： 2：6) DNA 復(fù)合物通過人體肝 HepG2 細(xì)胞中唾液酸糖蛋白缺乏受體高效識(shí)別，其轉(zhuǎn)染效率和 DNA 攝取率明顯高于 DCchol/DOPE（ 4:6） DNA 復(fù)合物。②電荷，糖基化陽(yáng)離子脂質(zhì)體 質(zhì)粒 DNA 復(fù)合物所帶的正電荷不能太高，否則不易與受體結(jié)合?？梢詫⑼庠?DNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞中，所使用的配體包括半乳糖、甘露糖、 188 乳糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和抗原等等。 ） mV。因此在具體研究中，必須對(duì)其分子量進(jìn)行篩選。對(duì)處于有絲分裂期的細(xì)胞而言，由于核膜已經(jīng)破裂，質(zhì)粒 DNA 容易進(jìn)入核內(nèi)；對(duì)于非分裂期細(xì)胞而言，質(zhì)粒 DNA 能否進(jìn)入核內(nèi)是轉(zhuǎn)染能否成功的關(guān)鍵。如果將陽(yáng)離子脂質(zhì)體DNA 復(fù)合物微量注射至細(xì)胞核內(nèi)，或?qū)⒙懵兜?DNA 直接注入胞漿中部不能對(duì)細(xì)胞有效轉(zhuǎn)染，而將質(zhì)粒 DNA 直接注入細(xì)胞核中卻獲得很高的基因表達(dá)。 ③ DNA 向核周圍的轉(zhuǎn)運(yùn) 當(dāng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物從核內(nèi)體中脫離以后，如何將 DNA 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核周圍成為一個(gè)新問題。 ②陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物脫離核內(nèi)體 質(zhì)粒 DNA 通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后必須從核內(nèi)體 (endosome)中脫離出來才能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，否則 DNA 將隨核內(nèi)體移至溶酶體，被大量的核酸酶降解，使轉(zhuǎn)染失敗。這是因?yàn)榉蚊?xì)血管是陽(yáng)離子脂質(zhì)體 [32P]DNA 復(fù)合物靜脈注射后面臨的第一個(gè)“陷阱”。已知血漿中的白蛋白會(huì)吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物上，使復(fù)合物的 Zeta 電位降低，減少?gòu)?fù)合物之間的電荷排斥力，導(dǎo)致復(fù)合物的聚集 [45]。起始時(shí)，脂質(zhì)體與 DNA 分子結(jié)合在核酸周圍形成群集的囊泡；當(dāng)達(dá)到臨界脂質(zhì)濃度時(shí)， DNA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)體融合和脂質(zhì)體引起的 DNA 萎縮開始發(fā)生，最終形成了脂質(zhì)包裹的 DNA 復(fù)合物。絕大多數(shù)陽(yáng)離子脂質(zhì)體需要一種中性的脂質(zhì)（如 DOPE）來達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染效果。極性頭部的有效體積大小還受靜電排斥力和氫鍵的進(jìn)一步影響。 Liczinger 等 [43]研究了脂質(zhì)體在水中的多種形態(tài)，證明脂質(zhì)最重要的兩種形態(tài)是 Lα 相和 HH 相，Lα 相是一種具有流動(dòng)性烴鏈的層狀結(jié)構(gòu)，而 HH 相是一種二維的六方晶相結(jié)構(gòu)。該復(fù)合物的直徑在 m~ m 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高；其次是直徑在 m~μ m 范圍內(nèi) , 直徑在 400nm 以下的復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率最低。為了使 DNA 在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，體外陽(yáng)離子脂質(zhì)體 基因復(fù)合物的正負(fù)電荷比約為 2： 1。結(jié)構(gòu)分析顯示，這種陽(yáng)離子聚多肽脂質(zhì)體為一電荷密集的、脂質(zhì)含量高、粒徑小于 100nm 的球形納米粒 [40,41]。其原理可能是因?yàn)?PLL和 DNA 之間的相互作用很強(qiáng)，可以形成濃縮的納米粒子，脂質(zhì)殼位于納米粒子的表面 [38]。目前，許多公司都推出了商品化的脂質(zhì)體試劑，常用的有 Lipofection、 SA、 DOGS 及 DOTMA?；蛑委煹年P(guān)鍵技術(shù)，是能將外源目的基因轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)并能有效適度表達(dá)。陽(yáng) 離子脂質(zhì)的疏水錨著區(qū)的主要功能是既為脂質(zhì)雙層提供足夠的流動(dòng)性，又能使脂質(zhì)雙層膜維持一定的剛性，以便為陽(yáng)離子脂質(zhì)體與體內(nèi)的脂質(zhì)融合創(chuàng)造條件。天然堿性脂目前主要為十八烷胺 (SA)。陽(yáng)離子去垢劑主要有 N[1(2， 3)二油烯氧基 ]丙基 N， N， N三甲基氯化銨（ DOTMA）、十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、十六烷基二甲基乙基溴化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨 (DDAB)、 N (α 三甲基乙?；?) 雙十二烷基 D谷氨酸、 1， 2二油烯氧基 3三甲胺基丙烷 (DOTAP)等。關(guān)于脂質(zhì)體文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)容很多，也有專著介紹。 （ 3）大單層脂質(zhì)體（ large unilamellar vesicles， LUV） 這是指直徑大于 1000nm 的由單層磷脂雙分子層膜組成的脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體大小范圍較寬，一般從 100nm~1000nm 不等，組成 MLV 的磷脂雙分子層有五層或更多，層數(shù)較少的的有時(shí)也稱為少層脂質(zhì)體（ oligolamellar liposomes）。脂質(zhì)體的直徑約在 25nm~1000nm 范圍內(nèi)，甚至更大。研究人員可以根據(jù)不同的目的對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾。 3． 保護(hù)性：藥物被脂質(zhì)體包封 后，受到脂質(zhì)體雙層膜的保護(hù)，可以顯著提高穩(wěn)定性，同時(shí)，還免受體內(nèi)的降解酶和免疫系統(tǒng)的分解，提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性。同其他的藥物載體系統(tǒng)相比，脂質(zhì)體具有以下作用特點(diǎn) [36]： 1． 靶向性：靶向性是脂質(zhì)體作為藥物載體最突出的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。 進(jìn)一步的研究重點(diǎn)需要了解 SLN進(jìn)入體內(nèi)后與體內(nèi)的生物環(huán)境之間的相互作用（吸附 /解吸附過程，酶解，聚合，和內(nèi)源性的脂類載體系統(tǒng)之間的作用）。樣品的稀釋或溶劑的蒸發(fā)會(huì)改變共存膠態(tài)體系之間的平衡和脂質(zhì)的物理狀態(tài)。 PLA 納米粒、 PLGA 納米粒和SLN 使人粒性白細(xì)胞的存活率降低 50%的濃度分別為 %， %，和大于 10%，這說明 SLN 的毒性最低 [34,35]，更適合作 為靜脈給藥系統(tǒng)藥物的載體。室溫下制備納米?？梢员苊馑幬飶乃嗟接拖嗟姆磸?fù)分配過程，因此藥物的突釋效應(yīng)很小。當(dāng)溫度下降 到脂質(zhì)結(jié)晶溫度時(shí)，脂質(zhì)基質(zhì)和溶解在其中的藥物開始形成固態(tài)的脂質(zhì)核，從而制得固態(tài)脂質(zhì)納米粒。用熱勻法制備納米粒時(shí)，油相中的藥物會(huì)重新溶解在水相中。在脫氫皮質(zhì)醇納米粒中，藥物被緩慢釋放而無明顯的突釋效應(yīng)，但是釋放曲線上開始仍會(huì)有一個(gè)釋放較快的階段，隨之是一個(gè)相對(duì)緩慢的階段。不管制備方法是熱勻法還是冷勻法，制備的含