elisa講義-wenkub
2024-11-19 05 本頁面
【正文】 ）發(fā)生免疫反應(yīng)結(jié)合后，,再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。,第八頁，共四十九頁。 1971年瑞典、荷蘭學(xué)者報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) 。,免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用 由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣。,第三頁，共四十九頁。,第二頁，共四十九頁。Ab]／[Ag][Ab] ,AgELISA、酶標(biāo)儀、洗板機,第一頁，共四十九頁。Ab的解離程度與K值有關(guān)。,2 抗原抗體反應(yīng)其次是特異性,抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間。,3 抗原抗體反應(yīng)顯現(xiàn)需合適比例,第四頁，共四十九頁。 如性激素的殘留測定,第六頁，共四十九頁。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)（immunoassay，IA） 。,基 本 原 理,它采用抗原與抗體特異的免疫反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，顯色產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，因此用于定量測定。,第十頁，共四十九頁。,第十一頁，共四十九頁。,1. ELISA的原理 2. ELISA的類型 3. 試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑 結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備 4. 對照設(shè)定 5. 標(biāo)本的采取和保存 6. 結(jié)果判斷,第十三頁，共四十九頁。,1. ELISA的原理,第十四頁，共四十九頁。 4. 受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。測定方法具有很高的敏感度（pgng/ml水平），并且重復(fù)性好。Ab]／[Ag][Ab] ,Ag,第十六頁，共四十九頁。,第十七頁，共四十九頁。,2 ELISA的類型,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。,雙抗體夾心法測抗原,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。,3. ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。 將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。 10%的小牛血清或1%明膠。,3.2 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B,結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑 1. 酶的催化活性 2. 抗體（或抗原）的免疫活性 3. 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4. 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 在ELISA中，HRP（辣根過氧化物酶），AP（堿性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，βD半乳糖苷酶和脲酶等。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。 DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS 。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。,3.3.2 AP的底物,3.3.3 酶反應(yīng)終止液 常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量。,第三十頁，共四十九頁。(簡稱洗滌，下同)。 3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。 6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“”號表示。,第三十一頁，共四十九頁。,基本操作注意事項：,基本操作： 加樣； 溫育； 洗滌； 讀板；,第三十三頁，共四十九頁。,第三十四頁，共四十九頁。,第三十五頁，共四十九頁。 建議在洗滌前進(jìn)行位置調(diào)節(jié)，吸針要到微孔底部，以降低殘留量。 如果作PCRELISA液罐應(yīng)加有1%次氯酸鈉，加入的量不得少于產(chǎn)生廢液的量。,洗板機的應(yīng)用范圍,所有涉及到96孔板換液、孵育、洗滌的實驗： ELI
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