elisa講義-預(yù)覽頁
【正文】 （1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑“（immunosorbent）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物“（conjugate）； （3）酶反應(yīng)的底物。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；A （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； B （3）酶的底物； C （4）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應(yīng)終止液,第二十三頁，共四十九頁。 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。,第二十五頁，共四十九頁。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。,第二十六頁，共四十九頁。 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。 ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。,第二十八頁，共四十九頁。,第二十九頁，共四十九頁。,酶標(biāo)基本步驟,用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。 2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。也可測O,第三十二頁，共四十九頁。,溫育,抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。,洗滌,洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。,洗板機(jī),手工洗滌流速較難控制，步驟繁瑣且耗費(fèi)時(shí)間，目前市面上多種洗板機(jī)可供選擇，其中以美國寶特的BIOTEK ELX50 洗板機(jī)最為突出 洗板機(jī)優(yōu)勢： 自動(dòng)化控制 精確度高 速度快（最快小于20S每板/每循環(huán)）,細(xì)胞包被層,ELx50洗滌 速度可調(diào)、角度最佳,手工洗滌或一般機(jī)器洗滌 角度不好，速度太快,第三十六頁，共四十九頁。因?yàn)橐话鉋LISA實(shí)驗(yàn)洗滌結(jié)束后要求扣板，但此步驟在PCRELISA中易造成污染，故殘留量應(yīng)盡量減少。每天使用完畢后應(yīng)用1%次氯酸鈉沖洗管路及清洗頭，然后用雙蒸水沖洗管路。,顯色,顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。,比色/讀板,將96孔板正確放入酶標(biāo)比色儀中，以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。,第三十九頁，共四十九頁。 檢測單位： 光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。因此，在測定檢測物時(shí)，我們選擇特定的波長進(jìn)行檢測，稱為測量波長。 光吸收ELISA： 單色器優(yōu)于濾光片，由于鹵素?zé)艄鈴?qiáng)大，兩者的靈敏度不相上下，單色器更為靈活、方便使用。,MD 公司：業(yè)界老大，產(chǎn)品質(zhì)量過硬，做工精細(xì)。 PE公司：著名的分析儀器生產(chǎn)商，但酶標(biāo)產(chǎn)品單一、簡單，后續(xù)支持不足。 設(shè)置酶標(biāo)儀上參數(shù)，即DEFINE定義 在MainMenu下，選DEFINE SELECT ASSAY NUMBER，進(jìn)行DEFINE定義： （1） METHOD（方法）：可定義波長及板類型 （2）MAP（排板）：可定義板的加樣的位置、數(shù)量、標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ瘴铮?（3）FORMULA（公式）：可定義CUTOFF定性臨界公式，中介值，結(jié)果判斷； （4）CURVE（曲線）：可定義定量下所使用的曲線的類型。 操作時(shí)環(huán)境溫度應(yīng)在15℃－40℃之間，環(huán)境濕度在15％－85％之間。 操作注意事項(xiàng) 嚴(yán)格按照試劑盒的說明書操作，反應(yīng)時(shí)間準(zhǔn)確。,第四十七頁，共四十九頁。,內(nèi)容總結(jié),ELISA、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)。陽性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)
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