elisa講義(存儲(chǔ)版)
【正文】 測(cè)方法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。,酶 純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。,3.3 試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物,DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2為供氧體， H2O2為受氫體。,E,3.3.1 HRP的底物,HRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(urea peroxide)。,3.4 對(duì)照設(shè)定,陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。 4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml 37℃10～30分鐘。,加樣,在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。 目的是洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì) 洗滌步驟： 1. 吸干孔內(nèi)反應(yīng)液； 2. 將洗滌液注滿板孔； 3. 放置2min，略作搖動(dòng)； 4. 吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。不能象一般ELISA操作一樣用力扣板。 反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。,酶標(biāo)儀,酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。,第四十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。但對(duì)中國(guó)支持服務(wù)較差、管理混亂。,第四十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。 請(qǐng)勿將樣品或試劑灑到儀器表面或內(nèi)部。其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素,第四十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。,第四十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。 保持干燥、干凈、水平的工作臺(tái)面，以及足夠的操作空間。,Biotek ELx800 酶標(biāo)儀的使用,先從試劑說(shuō)明書(shū)上獲得以下信息： （1）使用什么波長(zhǎng) （2）如何判斷結(jié)果。,ELx800 標(biāo)配濾光片 405, 450, 490, 630 nm 連續(xù)波長(zhǎng)(采用單色器),第四十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。如果選擇其它的波長(zhǎng)段，就會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為“A492nm“或“OD492nm“。,洗板機(jī)的應(yīng)用范圍,所有涉及到96孔板換液、孵育、洗滌的實(shí)驗(yàn)： ELISA 熒光ELISA 細(xì)胞洗滌 In Cell Western ……,第三十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。 建議在洗滌前進(jìn)行位置調(diào)節(jié)，吸針要到微孔底部，以降低殘留量。,第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。,第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。 3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。,第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)。,3.3.2 AP的底物,3.3.3 酶反應(yīng)終止液 常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,3.2 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B,結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑 1. 酶的催化活性 2. 抗體（或抗原）的免疫活性 3. 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4. 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 將抗原或抗體固定在過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。,2 ELISA的類(lèi)型,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。,第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。測(cè)定方法具有很高的敏感度（pgng/ml水平），并且重復(fù)性好。,1. ELISA的原理,第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。,第十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。,基 本 原 理,它采用抗原與抗體特異的免疫反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，顯色產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，因此用于定量測(cè)定。 如性激素的殘留測(cè)定,第六頁(yè)，共四十九頁(yè)。,2
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