elisa講義(完整版)
【正文】 先分離待檢物。Ab,抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag 3. 酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。,第十二頁，共四十九頁。,測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應結(jié)合后，,再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。 1971年瑞典、荷蘭學者報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) 。,第三頁，共四十九頁。Ab]／[Ag][Ab] ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。,3 抗原抗體反應顯現(xiàn)需合適比例,第四頁，共四十九頁。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)（immunoassay，IA） 。,第十頁，共四十九頁。,1. ELISA的原理 2. ELISA的類型 3. 試劑準備：免疫吸附劑 結(jié)合物 酶底物的準備 4. 對照設(shè)定 5. 標本的采取和保存 6. 結(jié)果判斷,第十三頁，共四十九頁。 4. 受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。Ab]／[Ag][Ab] ,Ag,第十七頁，共四十九頁。,雙抗體夾心法測抗原,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。,3. ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。 10%的小牛血清或1%明膠。 在ELISA中，HRP（辣根過氧化物酶），AP（堿性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，βD半乳糖苷酶和脲酶等。 DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS 。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。 加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質(zhì)的量。(簡稱洗滌，下同)。 6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“”號表示。,基本操作注意事項：,基本操作： 加樣； 溫育； 洗滌； 讀板；,第三十三頁，共四十九頁。,第三十五頁，共四十九頁。 如果作PCRELISA液罐應加有1%次氯酸鈉，加入的量不得少于產(chǎn)生廢液的量。適當提高溫度有助于加速顯色進行。,酶標儀的檢測原理,酶標儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。,酶標儀配件,濾光片和單色器： 濾光片和單色器各有優(yōu)缺點，選擇濾光片還是單色器和具體的實驗要求有關(guān)。進入中國市場十多年，市場占有率高，服務較好。,酶標儀的使用注意事項,工作環(huán)境 為延緩光學部件的老化，應避免陽光直射。 使用后蓋好防塵罩。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。加入的量應與試劑的敏感度相稱。,ELISA的操作要點,嚴謹?shù)脑O(shè)計，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。 操作電壓應保持穩(wěn)定。 Tecan 公司: 著名的液體分裝設(shè)備生產(chǎn)商，高端產(chǎn)品較好，底端產(chǎn)品較差。 熒光檢測ELISA 各有優(yōu)缺點，單色器靈活，但是靈敏度低、特異性差；濾光片特異性好、靈敏度高，但靈活性不足。 檢測單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD＝1og（1／trans），其中trans為檢測物的透光值。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。 定期維護、檢修儀器及配件。,洗板機使用注意事項, 有一定地洗滌次數(shù)：多次洗滌有利于取得好的效果，一般不超過6次。 溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。D值：在ELX808酶標儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O然后洗滌。,參考標準品,定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）
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