elisa講義(文件)
【正文】 SA 熒光ELISA 細(xì)胞洗滌 In Cell Western ……,第三十八頁，共四十九頁。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為“A492nm“或“OD492nm“。,酶標(biāo)儀的檢測(cè)原理,酶標(biāo)儀測(cè)定的原理是在特定波長(zhǎng)下，檢測(cè)被測(cè)物的吸光值。如果選擇其它的波長(zhǎng)段，就會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。,酶標(biāo)儀配件,濾光片和單色器： 濾光片和單色器各有優(yōu)缺點(diǎn)，選擇濾光片還是單色器和具體的實(shí)驗(yàn)要求有關(guān)。,ELx800 標(biāo)配濾光片 405, 450, 490, 630 nm 連續(xù)波長(zhǎng)(采用單色器),第四十三頁，共四十九頁。進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)十多年，市場(chǎng)占有率高，服務(wù)較好。,Biotek ELx800 酶標(biāo)儀的使用,先從試劑說明書上獲得以下信息： （1）使用什么波長(zhǎng) （2）如何判斷結(jié)果。,酶標(biāo)儀的使用注意事項(xiàng),工作環(huán)境 為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽光直射。 保持干燥、干凈、水平的工作臺(tái)面，以及足夠的操作空間。 使用后蓋好防塵罩。,第四十八頁，共四十九頁。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素,第四十九頁，共四十九頁。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱。其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。,ELISA的操作要點(diǎn),嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。 請(qǐng)勿將樣品或試劑灑到儀器表面或內(nèi)部。 操作電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。,第四十五頁，共四十九頁。 Tecan 公司: 著名的液體分裝設(shè)備生產(chǎn)商，高端產(chǎn)品較好，底端產(chǎn)品較差。但對(duì)中國(guó)支持服務(wù)較差、管理混亂。 熒光檢測(cè)ELISA 各有優(yōu)缺點(diǎn)，單色器靈活，但是靈敏度低、特異性差；濾光片特異性好、靈敏度高，但靈活性不足。,第四十一頁，共四十九頁。 檢測(cè)單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度， OD＝1og（1／trans），其中trans為檢測(cè)物的透光值。,酶標(biāo)儀,酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。 定期維護(hù)、檢修儀器及配件。不能象一般ELISA操作一樣用力扣板。,洗板機(jī)使用注意事項(xiàng), 有一定地洗滌次數(shù)：多次洗滌有利于取得好的效果，一般不超過6次。 目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì) 洗滌步驟： 1. 吸干孔內(nèi)反應(yīng)液； 2. 將洗滌液注滿板孔； 3. 放置2min，略作搖動(dòng)； 4. 吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。 溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。,加樣,在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。D值：在ELX808酶標(biāo)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O 4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml 37℃10～30分鐘。然后洗滌。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。,參考標(biāo)準(zhǔn)品,定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的45個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中.,陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。,3.4 對(duì)照設(shè)定,陽性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。,E,3.3.1 HRP的底物,HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。 TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。,3.3 試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物,DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2為供氧體， H2O2為受氫體。,結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)
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