【正文】 提供了 可能 ，同時 ， 對于免疫損傷性疾病 新城疫的研究 也 為我們 系統(tǒng)性研究 治療其他 免疫損傷性疾病 打下了 重要基礎(chǔ)。 1） α殼聚糖 和 β殼聚糖 抑制新城疫病毒 的最佳分子量分別為 4513Da 和 5743Da； 2） β殼聚糖的抗新城疫病毒活性明顯優(yōu)于α殼聚糖， β殼聚糖 在分子量為 3kDa6kDa 時，在直接抑制病 毒 的 接種 方式 下可有效降低血凝效價(jià)至 0，效果非常顯著 ； 3） 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖 顯著提高了 抗 新城疫 病毒活性 ，在直接抑制病毒的 試驗(yàn)中 可有效降低血凝效價(jià)至 0； 4）在濃度方面， 8g/L分子量為3624Da 和 2g/L 分子量為 5743Da 的 β殼聚糖 ， 1g/L的 6脫氧 N鄰苯二甲?；鶜ぞ厶呛?6脫氧 6溴代 N鄰苯二甲酰基殼聚糖均能 將 新城疫 病毒 血凝效價(jià) 降至 0。殼聚糖 作為天然存在的唯一帶正電荷的多糖， 具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗菌 、降脂、保濕 等 非常好的生理活性 ，且研究發(fā)現(xiàn)， 殼聚糖及其衍生物 可抑制幾十種植物病毒、類病毒的侵染 。 特別感謝奧蘭百特尹燕博老師課題組對抗病毒實(shí)驗(yàn)的支持與指導(dǎo)， 感謝張全斌老師課題組在儀器設(shè)備上的 幫助 與支持 ，也感謝家人一直以來的關(guān)心、支持與體諒。 萬分榮幸，能有這樣一位博學(xué)、謙遜、嚴(yán)謹(jǐn)而又善良的老師指導(dǎo)我青春里最重要的道路。一年的北上求學(xué)，兩年的實(shí)驗(yàn)探索，時至今日 已接近尾聲。本聲明的法律責(zé)任人由本人承擔(dān)。摘要 1 密級 :，，， 碩士學(xué)位論文 殼聚糖 衍生物 的制備及 其 抗新城疫病毒 活性 研究 作者姓名 ： 何曉飛 指導(dǎo)教師 : 邢榮娥副研究員 中國科學(xué)院海洋研究所 學(xué)位類別 : 學(xué)術(shù)型碩士 學(xué)科專業(yè) : 海洋藥物學(xué) 培養(yǎng)單位 : 中國科學(xué)院海洋研究所 學(xué)位授予單位： 中國科學(xué)院大學(xué) 20xx 年 05 月 致謝 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。 論文作者簽名： 日期： 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本人完全了解中國科學(xué)院海洋研究所有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意海洋研究所保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許學(xué)位論文被查閱和借閱。十分感謝三年來，我的指導(dǎo)老師 ——邢榮娥老師，在生活和學(xué)習(xí)上給予的悉心指導(dǎo)與幫助 ，讓我對過去充滿懷念、對現(xiàn)在充滿感恩、 對以后充滿信心 。 愿老師 在以后的工作生活中，萬事如意， 幸福安康！ 十分感謝三年來 課題組 李鵬程老師的 關(guān)心與指導(dǎo)，生活中，李老師平易近人、關(guān)心學(xué)生；科研中，李老師嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真，銳意創(chuàng)新。 學(xué)生 何曉飛摘要 1 摘要 新城疫是由新城疫病毒（ NDV）引起禽類的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型癥狀的高度接觸性、急性敗血性傳染病。 但其是否具有抗新城疫病毒活性，國內(nèi)外還未見報(bào)道。 熒光定量 PCR的測定結(jié)果 表明： 低分子量 α殼聚糖 、 β殼聚糖 都能有效增加 IL IFNα、 IFNβ、 TNFα等免疫因子的轉(zhuǎn)錄，但 并沒有 導(dǎo)致病毒 RNA的致謝 明顯下降。 關(guān)鍵詞 不同分子量 β殼聚糖 不同分子量 α殼聚糖 6胺代 6脫氧殼聚糖衍生物 新城疫病毒 抗病毒機(jī)理 摘要 3 ABSTRACT Newcastle disease (ND) is an acute septic and contact susceptible infectious disease caused by Newcastle disease virus (NDV). It resulted in blooding in respiratory tract and digestive tract mucosa. Currently, the treatments against ND are mainly adopts the prevention methods—— vaccines. In recent years, a large number of studies have shown that marine polysaccharide has antiviral activity and improve the body immunity. Chitosan as an only positively charged natural polysaccharide has terrific biological activities, such as the increase of immunity, antitumor, antibacterial, lipidlowering and moisturizing. What’s more important, chitosan and its derivatives were found that they can inhibit dozens of plant virus and viroid infection. But if it against NDV has not been reported at home and abroad. Therefore, we take chitosan with different molecular weight (Mw), different modified groups and different form as research object in this article to select the best product against Newcastle disease virus. The results indicated by the hemagglutination titer of allantoic fluid in chicken embryo. At the same time, using the fluorescent quantitative PCR technology, we detected the change of immune factors in order to determine that if the chitosan and its derivatives has activated and regulated the immune system in the process of antiviral. It’s useful to determine the influence of chitosan and its derivatives on the body39。 雞新城疫又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，主要特征是 呼吸困難、便稀、神經(jīng)紊亂、粘膜和漿膜出血，死亡率高 ，危害嚴(yán)重 [46]。而進(jìn)入第三道防線，特異性免疫階段則分為 免疫器官和免疫細(xì)胞兩部分，雞法氏囊和哈德氏囊是 重要的免疫器官?？梢姷竭_(dá)這些部位的抗體不是血液中循環(huán)抗體的機(jī)械滲透而 是來源于哈德氏腺 ND局部免疫的發(fā)生部位，正是 NDV的入侵門戶 [12]。同時病毒的侵入還破 壞了法氏囊內(nèi)的免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，由于這些免 疫活性細(xì)胞被破壞，當(dāng)用 ND疫苗進(jìn)行免疫時刺激機(jī)體巨噬細(xì)胞加工抗原、傳 遞信息的能力減少，各種免疫細(xì)胞的減少和功能的降低致使機(jī)體發(fā)生免疫抑制 現(xiàn)象或產(chǎn)生的免疫應(yīng)答減少，不能抵抗新城疫野毒的感染而發(fā)生非典型的新城 疫 [15]。雖然有多種疫苗和免疫方法，但是該病的發(fā)病率卻仍是居高不下 [10, 18]。干擾素只能 在感染病毒的早期使用，而且需要反復(fù)使用；阿昔洛韋容易對動物腎功能造成 損傷；頭孢拉定則導(dǎo)致動物血尿情況 [24]；病毒靈與病毒唑等一些藥物可以抑制普通的 感冒病毒，對其他病毒效果則不夠理想 [19]。 甲殼素的來源不同，構(gòu)型亦有所差異，可分為 α甲殼素、 β甲殼素和 γ甲殼 素 [29, 30]， 結(jié)構(gòu)的不同 導(dǎo)致其性質(zhì)也具有很大的差別。 然而 由于甲殼素 分子內(nèi)及分子間 較強(qiáng)的氫鍵作用，使得甲殼素結(jié)構(gòu)緊密 [31]，不溶于 水和大多數(shù)的有機(jī)溶劑，因此應(yīng)用受到限制 [37]。 因此 ， 殼聚糖的脫乙酰度， 也 成為 衡量其生理活性的 重要的技術(shù)指標(biāo)之一 [40]。 因此 脫乙酰 化 和分子量的調(diào)整成為殼聚糖開發(fā)應(yīng)用中 重要的 改性 [28]。 目前市售多為 7085%的中脫乙酰度 的 殼聚糖，適合于一般的生產(chǎn)，但 對殼聚糖 活性的不斷開發(fā)和應(yīng)用 則摘要 9 迫切需要 高甚至超高脫乙酰度 的 殼聚糖的 批量 制備。 高粘度的殼聚糖具有污水處理 、捕集重金屬及酶與細(xì)胞 固定化 等 作用 ；中粘度的殼聚糖， 主要用于紡織、印染、膠合劑；而低粘度的殼聚 糖則不僅在工業(yè)、食品 包裝方面應(yīng)用廣泛，且可作為口服抗酸劑，緩解胃酸， 控制人體膽固醇的吸收及制備多種藥劑 、 藥膏 [27, 46]。 氨基 和羥基 修飾對殼聚糖活性的影響 殼聚糖和甲殼素的化學(xué)修飾產(chǎn)生新的生物功能材料是目前主要研究領(lǐng)域，在不改變功能骨架的前提下，由于天然基團(tuán)的 引入保持并加強(qiáng)了其物理、生物、化學(xué)性質(zhì) [38]。 殼聚糖的生物活性與 2 位氨基 有著尤其緊密的關(guān)系。 殼聚糖 衍生物 抗病毒活性概述 海洋生物多糖從來源上可分為海藻多糖和海洋 動物多糖，目前多種海洋微生物也被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生生物活性多糖 [58]。殼聚糖作為單獨(dú)的抗病毒藥物可抑制幾十種植物病毒、類病毒的侵染，如對大豆花葉病毒和煙草花葉病毒，并對植物病毒種類沒有明確的局限性 [64, 65]，但與殼聚糖的分子量、聚合度、濃度及植物宿主種類有關(guān)。殼聚糖作為抗病毒藥物的載體的研究已經(jīng)屢見不鮮 [6163]， 而 作為單獨(dú)的抗病毒藥物 ， 可抑 制幾十種植物病毒、類病毒的侵染，如對大豆花葉病毒和煙草花葉病毒。 殼聚糖衍生物作為抗病毒首要的開發(fā)前景 海洋多糖來源豐富， 由于生長環(huán)境不同， 海洋動物、海洋植物以及海洋微生物都能合成出不同于陸地植物的帶有大量電 荷、含有糖醛酸及硫酸酯的多糖。 1958 年， GERBER首次報(bào)道了多糖硫酸酯 具有抗病毒活性，能強(qiáng)烈抑制具有包膜的病毒， DEREK HORTON 和 ERNST 殼聚糖氨基 上含有 硫酸根 對白血病病毒具有顯著抑制作用。 研究的內(nèi)容 、 目的和意義 近年來，由于環(huán)境污染及病毒基因組的變異性 ，許多前所未聞的病毒進(jìn)入人們的視野，引起恐慌。 雖然目前由于新城疫病毒的多發(fā)性而被我國規(guī) 定為強(qiáng)制免疫病種，在政府組織下進(jìn)行集中免疫 [72]。 海洋藥物已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。 因此，我們通過微波方法 及接枝 技術(shù) 制備不同 分子構(gòu)型、不同 分子量的高脫乙酰度殼聚糖 及其胺代衍生物 ， 并以此為 研究對象， 對雞胚尿囊液中血凝效價(jià)的降低作用 為指標(biāo) ， 篩選出最佳 分子構(gòu)型、 分子量 及衍生物產(chǎn)品 ；同時，采用熒光定量PCR技術(shù)，測定細(xì)胞因子在分子及蛋白水平的變化 ，以此確定殼聚糖 衍生物 在對抗 新城疫 病毒的過程中，對于免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)控， 從而確定殼聚糖 衍生物 對于機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響及藥效機(jī)制 ， 為殼聚糖硫酸酯成為預(yù)防與治療 新城疫 病毒的藥物打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本文采用過氧化氫微波輔助方法，降解α殼聚糖分子量在 1kDa10kDa 之間，并采用雞胚實(shí)驗(yàn)及相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)，測定新城疫病毒血凝效價(jià)的變化及經(jīng)過治療后的雞胚尿囊液中免疫因子 IL TLRIFNα/β及 TNFα的變化 ， 對殼聚糖 影響 新城疫 病毒的 RNA 含量也進(jìn)行了測定 。 （ LASOTA 雞新城疫病毒，原始病毒效價(jià)為 211， 96h 內(nèi)致雞胚死亡） ； 儀器 微波降解反應(yīng)器 （ MASII 型，上海 新儀 微波化學(xué) 科技 有