【正文】 ialenzyme,000個(gè)轉(zhuǎn)錄子，因此， 9個(gè)核苷酸序列可以代表所有轉(zhuǎn)錄子的特征。ST)，它含有確定的一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息量，可代表此轉(zhuǎn)錄物的特異性。原理 （兩個(gè)）： ① analysis序列；根據(jù)該推測(cè)的序列，可合成相應(yīng)的特異引物，進(jìn)行 PCR軟件中的 alignmentcloning)或生物信息學(xué)(bioinformatics)克隆新基因策略生物信息學(xué)克隆新基因策略是表達(dá)序列標(biāo)簽法的延伸和發(fā)展。通過(guò)基因文庫(kù)的篩選或基因定位的方法分離目的基因。 ② ① D.tag，簡(jiǎn)稱(chēng) EST：指基因序列中一段能特異地標(biāo)記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結(jié)構(gòu)信息以顯示出該基因與其他基因的差異，長(zhǎng)度一般為 100~50015（ 3）目的基因的化學(xué)合成法1979年， Khorana等首次化學(xué)合成基因有生物活性。Linker。② DNA互補(bǔ)鏈合成引物 合成反應(yīng)結(jié)束后，除去保護(hù)基團(tuán)， 29%濃氨水處理使寡聚核苷酸從載體上釋放出來(lái)，乙醇或異丙醇沉淀、回收 DNA。固相載體：是對(duì) DNA合成試劑惰性的物質(zhì)，目前采用可控孔徑的玻璃沙（ CPG） ,其表面的硅氧烷鍵可與 A、 G、 C、 T核苷的3`羥基以酯鍵連接，該鍵可用 29%濃氨水打斷。甲基化亞磷酰胺； ② 目前常用的方法是固相亞磷酸三酯法。 DNA進(jìn)一步證實(shí)和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)比較；分離插入片段進(jìn)行基因表達(dá)，用免疫方法或其他方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。 →雜交斑點(diǎn)（陽(yáng)性克?。?→ 分離重組 DNA分子 RNA探針 :cDNA探針 :寡核苷酸探針 :① 利用核酸探針與待分離 DNA的同源序列可進(jìn)行雜交的特點(diǎn)分離目的基因。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞可在纖維素平板上形成水解圈 轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞（ leu2, 具有新性狀細(xì)胞雖然有些受體細(xì)胞也能產(chǎn)生某種酶活性，但當(dāng)轉(zhuǎn)入目的基因后，該細(xì)胞可過(guò)量產(chǎn)生此酶活性，這亦可用于基因篩選。外源 DNA→對(duì)編碼產(chǎn)物未知的基因，采用特殊分離方法如差別顯示技術(shù)、差減雜交法、遺傳互補(bǔ)法等。已分離純化某蛋白，并知其氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作為探針，篩選基因文庫(kù)。cDNA文庫(kù)來(lái)自于模板 mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄及加工后 mRNA產(chǎn)物所攜帶的信息，所以從 cDNA文庫(kù)可以分離到基因的編碼序列?；蛭膸?kù)分基因組文庫(kù)和 cDNA文庫(kù)。 A代替二抗，再用 protein利用 DNA單鏈易與互補(bǔ)鏈形成雙鏈的原理，將已知基因 DNA與目的生物的 DNA進(jìn)行復(fù)性，再用單鏈核酸酶S1酶切除單鏈，留下的雙鏈即為目的基因序列5 基因 GC含量高（三個(gè)氫鍵）， Tm值高，熱穩(wěn)定性高，可通過(guò)控制解鏈溫度使富含 A=T區(qū)變性解鏈， 無(wú)論是已知序列或是尚未測(cè)序的序列都可進(jìn)行分離，只要確定目的基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)，就可用相應(yīng)的酶進(jìn)行切割，獲得目的基因。Gene） ：指基因工程中需要進(jìn)行制備、克隆或利用的基因。3） 了解 DNA連接酶和修飾酶在基因操作中的用途。the第五章 UniversityofofZhaoEngineering》《基因工程原理》Professor,andTechnology(趙德剛 )GuizhouAgriculturalLifeEmail:TheGene2第一節(jié) 制備目的基因要根據(jù)需要獲得 DNA片段，可能是啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子，或者是編碼某種蛋白完整的序列。 將 DNA切割成適當(dāng)片段，富含 GC的雙鏈DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速離心技術(shù)，可將 DNA片段按不同密度大小分開(kāi)。GC區(qū)維持雙鏈狀態(tài)，再利用單鏈核酸酶 S1酶切單鏈部分，獲得富含 GC的基因片段?；蚍g過(guò)程中，核糖體沿 mRNA進(jìn)行多肽鏈合成時(shí)形成多聚核糖核蛋白體。ASepharose64．利用酶促反轉(zhuǎn)錄直接從特定 mRNA分離基因此法是在目的基因的 mRNA占細(xì)胞中總 mRNA量很大時(shí)采用，直接用逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA，與載體重組后導(dǎo)入受體菌擴(kuò)增，獲得目的基因的 cDNA克隆?；蛭膸?kù)可用質(zhì)粒載體、 ?噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒（ cosmid）載體和酵母人工染色體（ YAC）載體進(jìn)行構(gòu)建。8篩選基因文庫(kù)的方法：① ③ 9遺傳互補(bǔ)法（功能互補(bǔ)法）原理： 當(dāng)把一外源 DNA片段引入一受體細(xì)胞后，如果受體細(xì)胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在合成培養(yǎng)基上 →如釀酒酵母的 MFα基因就是如此篩選到的。Leu） →→ 纖維素酶基因10核酸雜交法（同源序列克隆法）：（ 1)（ 2)DNA探針 :根據(jù)目的基因編碼蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列推測(cè)，人工化學(xué)合成。六肽 對(duì)應(yīng) mRNAN： ACGT/U利用特異性 由 T3或 T7啟動(dòng)子和相應(yīng)聚合酶轉(zhuǎn)錄其下游基因片段而得。 →6．特異性 DNA片段 (基因 )的 PCR擴(kuò)增 第一個(gè)核苷酸的 3`端通過(guò) 3`羥基與惰性固相載體上的間隔臂形成酯健，寡核苷酸按 3`5`方向進(jìn)行化學(xué)合成，正常終產(chǎn)物是 3`、 5`端均帶有羥基的寡聚核苷酸。223。13反應(yīng)分四步： 用三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（ DCA）處理，脫去連在固相載體上的核苷酸或寡核苷酸 5`羥基的 DMT保護(hù)基團(tuán)。由溶于無(wú)水乙腈中的四唑催化，使亞磷酰胺單體的 3`磷酸基團(tuán)與固相載體上的 5`羥基發(fā)生反應(yīng)，形成亞磷酸三酯鍵。加成反應(yīng)剩下的亞磷酰胺，以 N甲基瞇唑催化，用乙酸酐使羥基乙?；?，封閉其羥基，防止在下一循環(huán)中發(fā)生加成反應(yīng)。在堿性條件下，以碘使加成反應(yīng)形成的 3`， 5`亞磷酸三酯鍵氧化為穩(wěn)定的 5價(jià)磷酸三酯。用 RNA亞磷酸胺單體和聚苯乙烯固相載體，合成 RNA。DNA預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)化學(xué)合成的寡聚核苷酸片段，含有 1種或幾種酶切位點(diǎn)，酶切可產(chǎn)生粘性末端。③ 是一種化學(xué)合成的寡聚核苷酸，含有一種以上的內(nèi)切酶位點(diǎn)。DNA有全片段酶促連接法和酶促填充法。bp。Adam在 1991年建立并加以應(yīng)用，有的文獻(xiàn)稱(chēng)之為 從組織特異性或細(xì)胞特異性的 cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆，進(jìn)行 5‘端和 3’端部分序列（約 400通過(guò)對(duì)GenBank、 EMBL或其他核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聯(lián)機(jī)檢索，可以檢測(cè)出所測(cè)定序列及其對(duì)應(yīng)的多肽氨基酸序列。表達(dá)序列標(biāo)簽法分離目的基因有時(shí)可以從幾個(gè)不同基因的高度保守區(qū)得到相同的 cDNA片斷，有時(shí)一個(gè)較大的基因不同外顯子又能表現(xiàn)為若干不同的 cDNA。生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息學(xué)等學(xué)科相互交叉而誕生的一門(mén)新興學(xué)科，核心內(nèi)容是通過(guò)對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲(chǔ)、檢索與分析，進(jìn)而達(dá)到揭示數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義的目的。程序?qū)⑺鼈兤唇映梢粋€(gè) EST擴(kuò)增后，即可獲得該基因的 cDNA片斷。of從轉(zhuǎn)錄物某一特定位置上分離得到一段9~10bp理論上隨機(jī)排列的 9bp片斷可區(qū)分 262 ② AE，識(shí)別位點(diǎn)為 4堿基的限制性核酸內(nèi)切酶 )識(shí)別位點(diǎn)序列相隔相互連成雙標(biāo)簽序列 (ditag)的多聯(lián)體，將該多聯(lián)體序列克隆到一個(gè)載體中，用連續(xù)的方法進(jìn)行多聯(lián)體序列分析，再通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，確定每一種序列（ ST）代表轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的種類(lèi)和出現(xiàn)頻率，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄物的高效、快速和大量的分析。hybridization）或稱(chēng)為差別篩選 (differential以這兩種總 mRNA（或是它們的 cDNA減法雜交 （ subtractivecDNA，相應(yīng)地稱(chēng)為基因組 mRNA減法雜交原理： 從表達(dá)目的基因的組織中提取 mRNA并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后與無(wú)目的基因表達(dá)的組織中提取mRNA做過(guò)量雜交，在兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成 cDNA/mRNAanalysis原理 （兩個(gè)）： ① ST)，它含有確定的一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息量，可代表此轉(zhuǎn)錄物的特異性。000個(gè)轉(zhuǎn)錄子，因此， 9個(gè)核苷酸序列可以代表所有轉(zhuǎn)錄子的特征。enzyme,合成機(jī)械剪切 ligation使用連接頭 molecules粘性末端連接 termini同聚物尾巴 rebinanthostrebinantwithvitroChapternothatrequirementsA.genetoIntroducingintosynthesisRestrictiontheofofrebinantwithDNAgenesystemIntroducinginto6★ 看家基因（ Housekeepingmetabolism），表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在各生長(zhǎng)階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。metabolism★ 每一個(gè)細(xì)胞都會(huì)生產(chǎn)大量的特殊的 mRNAcellofmRNA ChapterDNAasprimerAlkalineH)strandT4fragmentproducemRNA ChapterATT5’AATT3’TcDNADNATTof