【正文】 標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)節(jié)儀器設(shè)置之后需用樣本優(yōu)化儀器設(shè)置。 8. 退出 FACSComp。 FL3和 FL4經(jīng)不同PMTs探測(cè)。 由于不同激光束在空間位置上的分離而導(dǎo)致一個(gè)顆粒在不同的時(shí)間產(chǎn)生信號(hào)。 FACSp用的標(biāo)準(zhǔn)微球 3色： 管＃ 1： 1ml 鞘液中加一滴未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球 管＃ 2： 3ml 鞘液中各加一滴未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球、 FITC－、 PE－、 PerCP標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球 4色： 管＃ 1： 1ml 鞘液中各加一滴未標(biāo)記的、 APC－標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球 管＃ 2： 3ml 鞘液中各加一滴未標(biāo) 記的標(biāo)準(zhǔn)微球、 FITC－、 PE－、 PerCP、APC－標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球 3. 啟動(dòng) FACSp：從蘋果菜單中選擇 FACSp 4. 在 Sign in 窗口中輸入必要信息后點(diǎn)擊 Accept 5. 選擇 LyseWash設(shè)置，在 Setup窗口中輸入必要信息 (如標(biāo)準(zhǔn)微球的 ID 號(hào) )后點(diǎn)擊Accept。 ? 建立模板 ? 輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果 質(zhì) 控－運(yùn)行 FACSComp 在此練習(xí)中，您將用 FACSComp軟件進(jìn)行儀器質(zhì)控。 ? 在獲取中，設(shè)定數(shù)據(jù)收集和儲(chǔ)存。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 7 練習(xí)： 3 色或 4色數(shù)據(jù)獲取 在此練習(xí)中，您將： ? 用 FACSComp軟件進(jìn)行儀器質(zhì)控。 只要被選圖才可以更改大小、刪除和移動(dòng)。一次可選擇多個(gè)圖。每次只能激活一個(gè)圖。 廢液 ： 顯示廢液桶是滿或 OK。 激光器電源： 以 mW表示，在 RUN時(shí)，為 15mW；在 Standby 時(shí)，為 3－ 6 mW 。在菜單位于 Cytometer菜單中 (見圖 5)。 補(bǔ)償調(diào)節(jié)如下： FL2－％ FL1： 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL1 FL1－％ FL2： 從 FL1探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL3－％ FL2： 從 FL3探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL2－％ FL3： 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL3 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 5 補(bǔ)償調(diào)節(jié)量依賴于探測(cè)器的電壓。 補(bǔ) 償： 當(dāng)樣本用 2色或 3色熒光染色時(shí)需調(diào)節(jié)補(bǔ)償以消除光譜重疊。 在免疫表型中， 在 FSC上設(shè)閾值。若放大模式選擇 Log(對(duì)數(shù) )，放大器的增益則不可調(diào)節(jié)。 (見圖 2) 放大器 ： 可對(duì)信號(hào)進(jìn)行微調(diào)。 光電倍增管 (PMTs)用于探測(cè) SSC、 FL FL FL3, 因?yàn)樗鼈兪侨跣盘?hào)。 E01：將信號(hào)放大 10(101)倍。 光電二 極管對(duì)光 的敏感度低于光電倍增管。 調(diào)節(jié)探測(cè)器和放大器可使所需信號(hào)出現(xiàn)在數(shù)據(jù)圖的適當(dāng)位置。 在用 CellQuest進(jìn)行 3色或 4色分析中，應(yīng)用同型對(duì)照和調(diào)補(bǔ)償用對(duì)照進(jìn)行儀器條件設(shè) 置。 CellQuest 的儀器控制： 在數(shù)據(jù)收集之前，需用樣本優(yōu)化儀器條件。除數(shù)據(jù)文件外所有條件（包括region、 gate、 statistics）都可以通用模板儲(chǔ)存。若二者聯(lián)系喪失，需將丟失的數(shù)據(jù)文件放在其實(shí)驗(yàn)文件同一目錄，實(shí)驗(yàn)文件才能找到其數(shù)據(jù)文件。數(shù)據(jù)文件不在實(shí)驗(yàn)文件中保存。當(dāng)Aqusition Control 窗口的 Setup前未打 ? 時(shí)，進(jìn)行獲取后自動(dòng)保存的文件格 式。 15. 箭頭：點(diǎn)擊，然后在實(shí)驗(yàn)文件中點(diǎn)擊，拖出直線。 10. 放大：點(diǎn)擊，然后點(diǎn)擊圖，將縮小圖放大到原大小。 6. 點(diǎn)圖：點(diǎn)擊，可畫點(diǎn)圖，可自定義圖的大小。 2. 選擇：點(diǎn)擊，可選擇一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)，進(jìn)行改大小或移動(dòng)。剛剛獲取的數(shù)據(jù)及在獲取時(shí)限定的格式出現(xiàn)在圖中 ，如 region, marker,color 等。 分析 將獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。 CellQuest軟件功能強(qiáng)大且靈活，并與 Macintosh 的多任務(wù)環(huán)境完全兼容。也可通過 CellQuest調(diào)節(jié)儀器條件，設(shè)定獲取最佳條件并 可將其儲(chǔ)存。在分析時(shí)，將讀取數(shù)據(jù)文件，然后可畫 Region(區(qū) )、 設(shè)置 marker (標(biāo)尺 )和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 工具板 工具欄可用來畫圖、 region, marker和文字等。 3. 3 維圖：點(diǎn)擊，可畫 3維圖，可自定義圖的大小。 7. 直 方圖 marker：點(diǎn)擊，可在直方圖上定位 marker 的左邊界和右邊界。 11. 矩形 region：點(diǎn)擊，然后在點(diǎn)圖、密度圖和等高圖中點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對(duì)角線至所需 大小。 16. 文本：點(diǎn)擊，然后點(diǎn)擊定位插入點(diǎn)并編輯文字。該文件含有從流式細(xì)胞儀獲取的平均 202010000個(gè)顆粒數(shù)的數(shù)據(jù)。 CellQuest實(shí)驗(yàn)文件的菜單由File菜單下 New、 open、 close、 save及 save as等 (同 Microsoft Word)。若實(shí)驗(yàn)文件的目錄改變，二者的聯(lián)系不會(huì)改變，實(shí)驗(yàn)文件仍可找到其數(shù)據(jù)文件。 ? 實(shí)驗(yàn)文件可轉(zhuǎn)化為文具薄。在優(yōu)化之前需運(yùn)行 FACSComp.。 同型對(duì)照包括下列試劑：小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。顆粒通過激光束時(shí)產(chǎn) 生光 信號(hào)，然后轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并在點(diǎn)圖上相對(duì)應(yīng)于一個(gè)道值。 光電二極管用于探測(cè) FSC，因?yàn)?FSC是強(qiáng)信號(hào)。 E02: 將信號(hào)放大 100(102)倍。 PMTs的電 壓調(diào)節(jié) 從 150－ 999。對(duì) FSC、 SSC、 FL FL FL3 可設(shè)置放大模式 和放 大增益。 對(duì)數(shù)常用 于 分開陰性信號(hào)和弱陽性信號(hào)。在 DNA分析中，在 FL2上設(shè)閾值。因?yàn)闊晒馑匕l(fā)射一定波段的熒光，因此在探測(cè)某種特定熒光素的探測(cè)器上有來源于另一種熒光素的熒光信號(hào)。當(dāng)補(bǔ)償過后的群體與陰性群體一致時(shí)，補(bǔ)償調(diào)節(jié)正確。 測(cè)試脈沖： 在 FACSCalibur中可從 status菜單中選擇 FSC(僅 FSC探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或ALL(所有探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或 OFF。 激光器電流 ： 顯示激光器電流值，當(dāng)高于某值時(shí)，在顯示屏上會(huì)出現(xiàn)提示信息 樣本電壓： 顯示樣本壓力和鞘液壓力之間的差異。 CellQuest 的視圖 在實(shí)驗(yàn)文件中，可畫圖和作統(tǒng) 計(jì)圖。 任何命令 只針對(duì)此激活的圖。任何命令可 影響被選擇的圖。 去選擇 ： 圖框的每個(gè)角無黑色方塊。 ? 在 CellQuest 中用樣本細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化。 ? 獲取和分析下列樣本： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC。 3色：用 FACSComp進(jìn)行 PMTs設(shè)置、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、敏感度測(cè)試。 6. 運(yùn)行 FACSp：依據(jù)圖條下方的提示框內(nèi)的信息進(jìn)行。如圖 7所示。 時(shí)間延遲校準(zhǔn)電子部件決定了細(xì)胞通過二個(gè)激光束之間需多少時(shí)間。當(dāng)打印對(duì)話框出現(xiàn)時(shí)，點(diǎn)擊 OK。上述優(yōu)化步驟不僅適用于溶解的 全血細(xì)胞，而且適用于任何感興趣的細(xì)胞。 小鼠 IgG1FITC/CD8PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC。 2. 啟動(dòng) CellQuest 軟件 3. 點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。 6. 從工具板中選擇點(diǎn)圖：點(diǎn)擊工具板中點(diǎn)圖圖標(biāo)。 9. X和 Y軸默認(rèn) FSC、 SSC Multicolor Gating.。 12. 從 Acquire菜單中選擇 Connect to Cytometer。出現(xiàn) Detectors/Amps窗口。將其拖至空白區(qū)。所有樣本管都可用來調(diào)節(jié)，一般用同型對(duì)照管來調(diào)。 2．在 FSC/SSC點(diǎn)圖上設(shè)淋巴細(xì)胞 Region，在 Region外點(diǎn)擊，將 R1拖至空白區(qū)。 用于同型對(duì)照的抗體為小鼠 抗鑰 孔嘁血藍(lán)素（ KLH）。特定抗體 Fab端與細(xì)胞表面上特定抗原的特異結(jié)合所發(fā)的熒光為陽性熒光。如獲 取 3色樣本，跳至第 8步。 9．點(diǎn)擊 FL1/FL2點(diǎn)圖，拖動(dòng) Marker的柄將 它設(shè)定在 101處。 14．若必要，調(diào)節(jié) FL FL2的電壓（在 Detector/Amps 窗口中），使這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 17．移去同型對(duì)照管。 選擇適當(dāng)?shù)脑噭┯脕碚{(diào)節(jié)補(bǔ)償很重要。一旦電壓設(shè)定，補(bǔ)償用單陽性管調(diào)節(jié)。 5．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/CD8PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 10．查看 FL2%FL3的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 13．查看 FL3%FL4的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 17．將儀器處于 Standby狀態(tài)。也可設(shè)定儲(chǔ)存的參數(shù)及其分辨率。然后數(shù)據(jù)按 Collection Criteria 窗口中的設(shè)置處理。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 15 8．點(diǎn)擊此對(duì)話框的 OK 9．點(diǎn)擊 Acquisition amp。 4．點(diǎn)擊 Parameter Description對(duì)話框的 File ，出現(xiàn)文件名編輯窗口。 11．將 Parameter Description對(duì)話框拖至適當(dāng)位置以不妨礙視野，勿關(guān)閉。點(diǎn)擊 OK 7．可在 Parameter Description對(duì)話框中選擇剛剛編輯的試劑 Panel。 2．在 Acqusition Control窗口 中不選 Setup。 8．選擇 Acqusition Control窗口 中的 Setup?？蓮?Cytometer菜單中選擇Instrument Setting。 3．在 Instrument Se