【正文】 標準微球調(diào)節(jié)儀器設(shè)置之后需用樣本優(yōu)化儀器設(shè)置。 8. 退出 FACSComp。 FL3和 FL4經(jīng)不同PMTs探測。 由于不同激光束在空間位置上的分離而導(dǎo)致一個顆粒在不同的時間產(chǎn)生信號。 FACSp用的標準微球 3色： 管＃ 1： 1ml 鞘液中加一滴未標記的標準微球 管＃ 2： 3ml 鞘液中各加一滴未標記的標準微球、 FITC－、 PE－、 PerCP標記的標準微球 4色： 管＃ 1： 1ml 鞘液中各加一滴未標記的、 APC－標記的標準微球 管＃ 2： 3ml 鞘液中各加一滴未標 記的標準微球、 FITC－、 PE－、 PerCP、APC－標記的標準微球 3. 啟動 FACSp：從蘋果菜單中選擇 FACSp 4. 在 Sign in 窗口中輸入必要信息后點擊 Accept 5. 選擇 LyseWash設(shè)置，在 Setup窗口中輸入必要信息 (如標準微球的 ID 號 )后點擊Accept。 ? 建立模板 ? 輸出統(tǒng)計結(jié)果 質(zhì) 控－運行 FACSComp 在此練習中，您將用 FACSComp軟件進行儀器質(zhì)控。 ? 在獲取中，設(shè)定數(shù)據(jù)收集和儲存。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 7 練習： 3 色或 4色數(shù)據(jù)獲取 在此練習中，您將： ? 用 FACSComp軟件進行儀器質(zhì)控。 只要被選圖才可以更改大小、刪除和移動。一次可選擇多個圖。每次只能激活一個圖。 廢液 ： 顯示廢液桶是滿或 OK。 激光器電源： 以 mW表示，在 RUN時，為 15mW；在 Standby 時，為 3－ 6 mW 。在菜單位于 Cytometer菜單中 (見圖 5)。 補償調(diào)節(jié)如下： FL2－％ FL1： 從 FL2探測器上減去重疊的 FL1 FL1－％ FL2： 從 FL1探測器上減去重疊的 FL2 FL3－％ FL2： 從 FL3探測器上減去重疊的 FL2 FL2－％ FL3： 從 FL2探測器上減去重疊的 FL3 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 5 補償調(diào)節(jié)量依賴于探測器的電壓。 補 償： 當樣本用 2色或 3色熒光染色時需調(diào)節(jié)補償以消除光譜重疊。 在免疫表型中， 在 FSC上設(shè)閾值。若放大模式選擇 Log(對數(shù) )，放大器的增益則不可調(diào)節(jié)。 (見圖 2) 放大器 ： 可對信號進行微調(diào)。 光電倍增管 (PMTs)用于探測 SSC、 FL FL FL3, 因為它們是弱信號。 E01：將信號放大 10(101)倍。 光電二 極管對光 的敏感度低于光電倍增管。 調(diào)節(jié)探測器和放大器可使所需信號出現(xiàn)在數(shù)據(jù)圖的適當位置。 在用 CellQuest進行 3色或 4色分析中，應(yīng)用同型對照和調(diào)補償用對照進行儀器條件設(shè) 置。 CellQuest 的儀器控制： 在數(shù)據(jù)收集之前，需用樣本優(yōu)化儀器條件。除數(shù)據(jù)文件外所有條件（包括region、 gate、 statistics）都可以通用模板儲存。若二者聯(lián)系喪失，需將丟失的數(shù)據(jù)文件放在其實驗文件同一目錄，實驗文件才能找到其數(shù)據(jù)文件。數(shù)據(jù)文件不在實驗文件中保存。當Aqusition Control 窗口的 Setup前未打 ? 時，進行獲取后自動保存的文件格 式。 15. 箭頭：點擊，然后在實驗文件中點擊，拖出直線。 10. 放大：點擊，然后點擊圖，將縮小圖放大到原大小。 6. 點圖：點擊，可畫點圖，可自定義圖的大小。 2. 選擇：點擊，可選擇一個或多個目標，進行改大小或移動。剛剛獲取的數(shù)據(jù)及在獲取時限定的格式出現(xiàn)在圖中 ，如 region, marker,color 等。 分析 將獲取的數(shù)據(jù)進行進一步分析。 CellQuest軟件功能強大且靈活，并與 Macintosh 的多任務(wù)環(huán)境完全兼容。也可通過 CellQuest調(diào)節(jié)儀器條件，設(shè)定獲取最佳條件并 可將其儲存。在分析時，將讀取數(shù)據(jù)文件，然后可畫 Region(區(qū) )、 設(shè)置 marker (標尺 )和進行統(tǒng)計。 工具板 工具欄可用來畫圖、 region, marker和文字等。 3. 3 維圖：點擊，可畫 3維圖，可自定義圖的大小。 7. 直 方圖 marker：點擊，可在直方圖上定位 marker 的左邊界和右邊界。 11. 矩形 region：點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需 大小。 16. 文本：點擊，然后點擊定位插入點并編輯文字。該文件含有從流式細胞儀獲取的平均 202010000個顆粒數(shù)的數(shù)據(jù)。 CellQuest實驗文件的菜單由File菜單下 New、 open、 close、 save及 save as等 (同 Microsoft Word)。若實驗文件的目錄改變，二者的聯(lián)系不會改變，實驗文件仍可找到其數(shù)據(jù)文件。 ? 實驗文件可轉(zhuǎn)化為文具薄。在優(yōu)化之前需運行 FACSComp.。 同型對照包括下列試劑：小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。顆粒通過激光束時產(chǎn) 生光 信號，然后轉(zhuǎn)換成電信號，并在點圖上相對應(yīng)于一個道值。 光電二極管用于探測 FSC，因為 FSC是強信號。 E02: 將信號放大 100(102)倍。 PMTs的電 壓調(diào)節(jié) 從 150－ 999。對 FSC、 SSC、 FL FL FL3 可設(shè)置放大模式 和放 大增益。 對數(shù)常用 于 分開陰性信號和弱陽性信號。在 DNA分析中，在 FL2上設(shè)閾值。因為熒光素發(fā)射一定波段的熒光，因此在探測某種特定熒光素的探測器上有來源于另一種熒光素的熒光信號。當補償過后的群體與陰性群體一致時，補償調(diào)節(jié)正確。 測試脈沖： 在 FACSCalibur中可從 status菜單中選擇 FSC(僅 FSC探測器上產(chǎn)生的信號 )或ALL(所有探測器上產(chǎn)生的信號 )或 OFF。 激光器電流 ： 顯示激光器電流值，當高于某值時，在顯示屏上會出現(xiàn)提示信息 樣本電壓： 顯示樣本壓力和鞘液壓力之間的差異。 CellQuest 的視圖 在實驗文件中，可畫圖和作統(tǒng) 計圖。 任何命令 只針對此激活的圖。任何命令可 影響被選擇的圖。 去選擇 ： 圖框的每個角無黑色方塊。 ? 在 CellQuest 中用樣本細胞進行優(yōu)化。 ? 獲取和分析下列樣本： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC。 3色：用 FACSComp進行 PMTs設(shè)置、補償調(diào)節(jié)、敏感度測試。 6. 運行 FACSp：依據(jù)圖條下方的提示框內(nèi)的信息進行。如圖 7所示。 時間延遲校準電子部件決定了細胞通過二個激光束之間需多少時間。當打印對話框出現(xiàn)時，點擊 OK。上述優(yōu)化步驟不僅適用于溶解的 全血細胞，而且適用于任何感興趣的細胞。 小鼠 IgG1FITC/CD8PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC。 2. 啟動 CellQuest 軟件 3. 點擊實驗文件的右上角的放大鈕，將實驗文件窗口放大。 6. 從工具板中選擇點圖：點擊工具板中點圖圖標。 9. X和 Y軸默認 FSC、 SSC Multicolor Gating.。 12. 從 Acquire菜單中選擇 Connect to Cytometer。出現(xiàn) Detectors/Amps窗口。將其拖至空白區(qū)。所有樣本管都可用來調(diào)節(jié)，一般用同型對照管來調(diào)。 2．在 FSC/SSC點圖上設(shè)淋巴細胞 Region，在 Region外點擊，將 R1拖至空白區(qū)。 用于同型對照的抗體為小鼠 抗鑰 孔嘁血藍素（ KLH）。特定抗體 Fab端與細胞表面上特定抗原的特異結(jié)合所發(fā)的熒光為陽性熒光。如獲 取 3色樣本，跳至第 8步。 9．點擊 FL1/FL2點圖，拖動 Marker的柄將 它設(shè)定在 101處。 14．若必要，調(diào)節(jié) FL FL2的電壓（在 Detector/Amps 窗口中），使這群細胞調(diào)在所有圖的左下角。 17．移去同型對照管。 選擇適當?shù)脑噭┯脕碚{(diào)節(jié)補償很重要。一旦電壓設(shè)定，補償用單陽性管調(diào)節(jié)。 5．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/CD8PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 10．查看 FL2%FL3的補償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補償。 13．查看 FL3%FL4的補償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補償。 17．將儀器處于 Standby狀態(tài)。也可設(shè)定儲存的參數(shù)及其分辨率。然后數(shù)據(jù)按 Collection Criteria 窗口中的設(shè)置處理。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 15 8．點擊此對話框的 OK 9．點擊 Acquisition amp。 4．點擊 Parameter Description對話框的 File ，出現(xiàn)文件名編輯窗口。 11．將 Parameter Description對話框拖至適當位置以不妨礙視野，勿關(guān)閉。點擊 OK 7．可在 Parameter Description對話框中選擇剛剛編輯的試劑 Panel。 2．在 Acqusition Control窗口 中不選 Setup。 8．選擇 Acqusition Control窗口 中的 Setup?？蓮?Cytometer菜單中選擇Instrument Setting。 3．在 Instrument Se