【正文】 tting窗口中點(diǎn)擊 Done。 3．在 Instrument Setting窗口中點(diǎn)擊 Set、 Done。如聯(lián)合 CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC 在一管， CD3FITC/ CD16+56PE/CD45PerCP/CD19APC在第二管，即可評價 %T細(xì)胞、 %Th、 %Tc、 %NK、 %B等。 1．創(chuàng)建一個新的 CellQuest實(shí)驗(yàn)文件（ File菜單下的 New） 2．從工具板中選擇點(diǎn)圖，出現(xiàn)點(diǎn)圖對話框 3．點(diǎn)擊 Select File，選擇一定目錄下的第一管的數(shù)據(jù)文件： 3色：小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP 或 4色：小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC 4． X軸參數(shù)： FL3H， Y軸參數(shù)： SSCH 5．點(diǎn)擊 Multicolor gating 6．點(diǎn)擊 OK 7．在淋巴細(xì)胞群上畫一個多邊形的 Region。該點(diǎn)圖分為 4個象限， UL：左上，僅 FL2+ UR：右上， FL1+和 FL2+ LL：左下， FL1和 FL2 LR：右下，僅 FL2+ 在小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE（同型對照）的 FL1H/FL2H點(diǎn)圖上，幾乎所有的細(xì)胞應(yīng)在 LL象限。 3．創(chuàng)建一個 FL1H/FL3H點(diǎn)圖（小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1APC） 4．設(shè)定象限 marker，使得同型對照管門內(nèi)細(xì)胞群在左下象限。 5． 11． 5 分析數(shù)據(jù) 在此部分，將計(jì)算淋巴細(xì)胞、 T細(xì)胞、 B細(xì)胞、 NK細(xì)胞的百分?jǐn)?shù) 1．從同型對照管的 FL1H/FL2H點(diǎn)圖上得出門內(nèi)細(xì)胞 %LL（左下象限）。 2．用 同樣方法將其余點(diǎn)圖都改成 No file。 4．關(guān)閉 info 窗口。 2．從 File 菜單選擇 Open，出現(xiàn)對話框。由 4種 Region：長方形、橢圓形、多邊形及直方圖 Region。 重新定義 Region 大小 ： 在 Region邊界上點(diǎn)擊一次，在 Region的 4角各出現(xiàn)一個柄點(diǎn)，點(diǎn)擊并沿 X或 Y軸拖動即可。在 Region邊界上 雙擊，或在 Region邊界上點(diǎn)擊一次、然后從 Gate 菜單中選擇 Edit Ploygon。但要真正刪除 Region，必須從 Gate 菜單中選擇 Region List中刪除。設(shè)門可以限定分析或分選的細(xì)胞群。 1．在 FL1/FL2點(diǎn)圖中，在 CD3CD4+細(xì)胞群上畫 R4。 更改 Gate list 中門的次序： 門內(nèi)細(xì)胞群的顏色是依 Gate list中的門的次序而定，可更改 Gate list的次序，而改變門內(nèi)細(xì)胞群的顏色。 5． 12． 6 組合門 多個 Region組合而成復(fù)雜的門可以用來分析或分選。 Not R1（或 R1）： 所有不在 R1內(nèi)的細(xì)胞群都滿足該門的要求。 例：設(shè)門捕獲所有 CD4+ 細(xì)胞 1．確認(rèn)所有圖是顯示所有細(xì)胞（即選擇 No Gate） 2．在 FL1/FL2點(diǎn)圖上在 CD3+CD4+細(xì)胞群上畫 R6，在 CD3+CD4細(xì)胞群上畫 R7 3．從 Gate 菜單中選擇 Gate list，限定 G8=R4 or R6，回車 4．關(guān)閉 Gate list窗口 5．激活 FL1/FL2點(diǎn)圖，從 Stats菜單上選擇 Gate Stats，注意統(tǒng)計(jì)結(jié)果 6．從 Plot菜單上選擇 Format Dot Plot，選擇 G1=R1，點(diǎn)擊 OK，注意統(tǒng)計(jì)結(jié)果的改 變。 12．從 Stats菜單選擇 Histogram Stats（直方圖 統(tǒng)計(jì)），注意 M2統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 5． 12． 7 在直方圖上使用組合門分析 1．從 Region list 中刪除所有 Region，刪除所有統(tǒng)計(jì)窗口 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 26 2．在 Gate list中選擇 Set All to Default 3． Format所有圖是顯示所有細(xì)胞（即選擇 No Gate） 4．將 FSC/SSC點(diǎn)圖更改為 FL1（ CD3FITC） /SSC 5．在 CD45PerCP/SSC點(diǎn)圖淋巴細(xì)胞上畫 R1 6．在 CD3/SSC點(diǎn)圖 CD3+細(xì)胞上畫 R2 7．從 Gate 菜單中選擇 Gate list，限定 G3=R1 and R2，回車 8．雙擊 G3標(biāo)記，更名為 T lymphocyte，關(guān)閉 Gate list窗口。 2．邏輯運(yùn)算關(guān)系：先 Not， 然后 and，其次 or。 R1 and R2（或 R1*R2）： 同時在 R1和 R2內(nèi)的細(xì)胞才是滿足該門的要求。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 25 2．為將 嗜堿粒細(xì)胞群落顯示銹色，在 Gate list中將 G5移至首位。 5． 12． 5 多色門 1．激活 FSC/SSC點(diǎn)圖，從 Plot菜單上選擇 Format Dot Plot 2．在對話框中選擇 Multicolor Gating，選擇 No gate，點(diǎn)擊 OK， 3． 在另外二個點(diǎn)圖上重復(fù) 2步，點(diǎn)圖上淋巴細(xì)胞呈紅色、單核細(xì)胞呈綠色、粒細(xì)胞呈橘黃色。 反向設(shè)門： 反向設(shè)門可以用于顯示在某一圖上的細(xì)胞群在另一圖上的位置。 5． 12． 3 用 Region 統(tǒng)計(jì)來分析數(shù)據(jù) 1．在 FSC/SSC點(diǎn)圖上設(shè)一多邊形淋巴細(xì)胞 Region，為 R1 2．設(shè)一橢圓形單核細(xì)胞 Region，為 R2 3．設(shè)一長方形粒細(xì)胞 Region，為 R3 4．激活點(diǎn)圖，從 Stats菜單選擇 Region Stats（ Region 統(tǒng)計(jì)）。從 Gate 菜單中選擇 Stop Edit Region即可停止。從 Gate 菜單中選擇 Stop Rotate Region即可停止。 3．將 Region的符號 R1移至 Region旁。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 23 4．在 Text Import Wizard窗口，點(diǎn)擊 finish，查看結(jié)果。 5． 11. 8 將統(tǒng)計(jì)改為電子表格 將在分析中儲存的輸出文件改為電子表格。 1．選擇目錄和模板 2．從 File 菜單選擇 Get info，所選模板的 info 窗口出現(xiàn)。 2．從第二管的數(shù)據(jù)中得出 CD3+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)， CD3+CD8+Tc細(xì)胞百分?jǐn)?shù) 若 4色，從第二管的數(shù)據(jù)中可得出 CD3+CD4+Th細(xì)胞百分?jǐn)?shù) 3．從第三管的數(shù)據(jù)中得出 CD3CD16+56+NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù) 若 4色，從第三管的數(shù)據(jù)中可得出 CD19+B細(xì)胞百分?jǐn)?shù) 5． 11． 6 將分析文件以模板形式保存 通用模板可用于常規(guī)獲取或分析，所有條件包括 region、 marker、 statistic等都儲存下來。 5． 11． 4 批分析其余數(shù)據(jù) 1． 從 Batch菜單中選擇 Setup，出現(xiàn) Batch Setup對話框。 若分析 3色數(shù)據(jù)，跳至 , 若分析 4色 , 請參見 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 21 5． 11． 3 分析四色 1. File菜單下的選擇文件大小 ,文件大小對話框出現(xiàn)。 8．重復(fù) 23步； 9． X軸參數(shù)： FL1H， Y軸參數(shù)： FL2 –H 10．選擇 G1=R1 11．點(diǎn)擊 Multicolor gating ， OK BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 20 5． 11． 2 限定象限 marker 1．在小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE（同型對照）的 FL1H/FL2H點(diǎn)圖上設(shè)定象限 marker，使得門內(nèi)細(xì)胞群在左下象限。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 19 在此練習(xí)中，您將： ? 用 CD45設(shè)淋巴細(xì)胞門 ? 用點(diǎn)圖分析 3色、 4色數(shù)據(jù) ? 在 CellQuest使用批分析 ? 生成一個含統(tǒng)計(jì)分析的輸 出文件 ? 將分析文件以模板形式保存 5． 11． 1 畫 Region1 CD45表達(dá)在所有白細(xì)胞表面，淋巴細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。 從 File菜單中選擇 save，出現(xiàn)文件保存對話框，選擇或創(chuàng)建文件目錄及文件名， 點(diǎn)擊save。出現(xiàn) Instrument Setting窗口。出現(xiàn) Instr